Ensaio de biossensor bacteriano para detecção de mercúrio biodisponível em condições anaeróbicas

Resumo

Fonte: Stenzler, B. R. et. al., Um ensaio de biossensor anaeróbico para a detecção de mercúrio e cádmio. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o uso de biossensores bacterianos geneticamente modificados para medir com precisão a fração biodisponível de íons de mercúrio em condições anaeróbicas. Ao variar a concentração de sulfato de magnésio, o ensaio garante que o biossensor responda seletivamente aos íons de mercúrio livres, conforme indicado pelas mudanças na intensidade da fluorescência.

Protocolo

1. Ensaio de Exposição

1. Projetando um layout de placa.
   NOTA: Certifique-se de ter todos os valores de pipetagem calculados e estoques preparados antes de iniciar o ensaio de exposição. Como projetar adequadamente um experimento e quais controles incluir são detalhados no texto. Além disso, o experimento não deve ser iniciado se houver oxigênio na câmara anaeróbica indicada no monitor anaeróbico.
2. Projete o layout da placa de acordo com um modelo de 96 poços. Isso permitirá que 32 tratamentos diferentes executem experimentos em réplicas técnicas de 3, o que é melhor representado por uma grade 4 x 8 para configurar frascos (veja a Figura 1).

NOTA: Ao testar o papel de uma variável na absorção de Hg com o biossensor induzível por mercúrio, dois tratamentos são necessários para cada variável: o tratamento (biossensor + mercúrio (Hg) + variável + nitrato) e seu tratamento em branco (biossensor + variável + nitrato). Ao testar o papel de uma variável na fisiologia da célula usando o biossensor constitutivo, dois tratamentos são necessários para cada variável: o tratamento (biossensor + Hg + variável + nitrato) e o tratamento em branco (biossensor + variável + Hg). O mercúrio pode ser substituído por cádmio (Cd). Hg ou Cd se tornarão a variável ao realizar uma curva de calibração. Os biossensores constitutivos e induzíveis não precisam ser executados ao mesmo tempo (no mesmo layout de placa). Um exemplo de modelo para o layout da placa e a grade 4 x 8 correspondente ao testar uma faixa de concentração de magnésio (variável) é fornecido na Tabela 1.

2. Configure a grade 4 x 8 de acordo com o layout da placa de ensaio.

1. Coloque 7 mL de frascos padrão de politetrafluoretileno (PTFE) na bandeja.
NOTA: Os frascos de PTFE devem ser lavados com ácido ou esterilizados por calor antes do uso. Eles só devem ser manuseados manipulando a parte externa do frasco.

2. A cada frasco, adicionar o volume do meio de exposição correspondente a cada tratamento.
NOTA: Em uma exposição com um volume total de 2.000 μL (2 mL), o meio de exposição adicionado será: meio de exposição μL = 2.000 μL – tratamento (em branco) μL. (por exemplo, meio de exposição μL = 2.000 – 100 μL (biossensor) – 40 μL (nitrato) – 100 μL (Hg) – 100 μL (variável (por exemplo, sulfato de magnésio, MgSO₄)) = 1660 μL). Certifique-se de que o volume adicionado da variável testada não exceda 5% (100 μL) do volume final.

3. Adicionar o volume correspondente da solução da variável química a ser testada a cada frasco, de acordo com o layout da placa.

4. Adicione nitrato a cada frasco para injetáveis de modo que a concentração final seja de 200 μM (40-80 μL). Exclua esta etapa para brancos de tratamento de biossensor constitutivo.

5. Adicione Hg (5 nM ao testar uma variável) ou Cd (300 nM ao testar uma variável) aos frascos de acordo com o layout da placa. Exclua esta etapa para blanks de tratamento de biossensores induzíveis por mercúrio.

1. Ao usar Hg, pegue o estoque de 4-8 μM e agite bem. Diluir a solução em meio de exposição num frasco para injetáveis de PTFE de 7 ml a 100-250 nM para obter uma solução de Hg funcional. A partir desta solução de trabalho, adicione Hg aos frascos necessários. Neste caso, uma curva de calibração de Hg variando de 0 a 12,5 nM.
NOTA: Ao testar o efeito de uma variável na biodisponibilidade de Hg ou Cd, certifique-se de que o [Hg] ou [Cd] permaneça constante em todos os tratamentos. Ao adicionar Hg ou Cd, certifique-se de usar uma ponta de pipeta, mas nunca toque no meio de exposição nos frascos.

Agite em movimento orbital manualmente.
NOTA: O experimento pode ser pausado agora, dependendo do tempo necessário para que Hg ou Cd especiem em solução. Se deixado por mais de uma hora, coloque tampas de PTFE nos frascos de PTFE para evitar evaporação / contaminação.

Pipete suavemente o Biosensor Stock para frente e para trás para garantir a homogeneidade. Adicione 100 μL de estoque de biossensor a cada frasco. Agite orbitalmente manualmente.

Prepare o leitor de placas para aquecer para ler com os seguintes critérios: temperatura a 37 ° C, corrida cinética por 10 horas com leituras a cada 2.5-5 minutos com agitação orbital entre as leituras e medições de fluorescência com excitação de fluorescência de 440 nm e emissão de 500 nm.

Pipete 200 μL de cada frasco de PTFE na grade 4 x 8 nos poços correspondentes da placa de 96 poços (Microplacas de superfície não vinculativa de fundo transparente de 96 poços pretos). Pipete para frente e para trás cinco vezes antes de transferir cada 200 μL.NOTA: Em vez de descartar a ponta da pipeta, deixe a ponta da pipeta no frasco de PTFE para acompanhar o progresso da pipetagem.

Coloque a placa de 96 poços na bandeja do leitor de placas, coloque a tampa na placa de 96 poços e comece o ensaio.

 

Tabela 1: Um exemplo de layout de placa para usar o biossensor para testar a biodisponibilidade de Hg (5 nM) em um gradiente de magnésio (0-10 mM)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

um

Biossensor induzido por Hg + Hg + Nitrato + 0 mM Mg

Biossensor induzido por Hg + Nitrato + 0 mM Mg

Biossensor constitutivo + Hg + Nitrato + 0 mM Mg

Biossensor constitutivo + Hg + 0 mM Mg

b

Biossensor induzido por Hg + Hg + Nitrato + 0,1 mM Mg

Biossensor induzido por Hg + Nitrato + 0,1 mM Mg

Biossensor constitutivo + Hg + Nitrato + 0,1 mM Mg

Biossensor constitutivo + Hg + 0,1 mM Mg

c

Biossensor induzido por Hg + Hg + Nitrato + 1 mM Mg

Biossensor induzido por Hg + Nitrato + 1 mM Mg

Biossensor constitutivo + Hg + Nitrato + 1 mM Mg

Biossensor constitutivo + Hg + 1 mM Mg

d

Biossensor induzido por Hg + Hg + Nitrato + 10 mM Mg

Biossensor induzido por Hg + Nitrato + 10 mM Mg

Biossensor constitutivo + Hg + Nitrato + 10 mM Mg

Biossensor constitutivo + Hg + 10 mM Mg

Materiais