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1. Reagentes para a preparação do ensaio
- Preparar a solução de arsenito-citrato.
- Pesar 5 g de arsenito de sódio e 5 g de citrato trissódico di-hidratado.
CUIDADO: O arsenito de sódio é tóxico; portanto, use equipamento de proteção adequado e manuseie com cuidado especial. Como precaução, não manuseie antes de todas as precauções de segurança necessárias terem sido lidas e compreendidas. Manusear apenas em um exaustor para não inalar poeira/vapores do composto ou sua(s) solução(ões). Se inalado, vá para o ar fresco e procure atendimento médico. Use óculos de segurança química apropriados, luvas de proteção e roupas para evitar a ingestão e o contato olho/pele. Se ingerido, ligue imediatamente para um centro de envenenamento ou médico / médico. Se entrar em contato com a pele ou o(s) olho(s), lave com água em abundância e procure atendimento médico. - Dissolva em 100 mL de água.
- Adicione 5 mL de ácido acético glacial, misture e adicione água a 250 mL.
- Armazenar em temperatura ambiente, protegido da luz.
NOTA: A solução é estável por mais de um ano.
- Prepare a solução A e a solução B.
- Para a solução A, adicione 10 mL de HCl 0,5 M gelado (ácido clorídrico) a 0,3 g de ácido ascórbico. Dissolver o ácido ascórbico por vórtice.
- Para a solução B, adicione 1 mL de água gelada a 70 mg de heptamolibdato de amônio tetrahidratado e vórtice para dissolver.
NOTA: Armazene ambas as soluções no gelo até o uso. Para a consistência do resultado do ensaio, ambas as soluções podem ser armazenadas em gelo por no máximo uma semana.
- Prepare o padrão de fosfato (Pi) com a concentração de 0 μM, 62.5 μM, 250 μM e 500 μM para calibração.
- Adicione 0 μL, 25 μL, 50 μL e 100 μL de 5 mM Na2HPO4 (fosfato dissódico) di-hidratado a quatro microtubos contendo 370 μL da mistura de reação.
- Complete até 1 mL com água.
2. Ensaio de atividade para uma placa de 96 poços
NOTA: Consulte a Figura 1 para obter o fluxo de trabalho esquemático do ensaio.
- Adicione 1 mL da solução B a 10 mL da solução A, misture por vórtice e armazene a solução no gelo.
NOTA: Esta solução deve ser transparente e amarela. Mantenha a solução A + B no gelo por pelo menos 30 minutos antes de usar. No entanto, use a solução dentro de 3 h, pois ela estragará após o armazenamento de longo prazo. - Adicione 40 μL de 0 μM, 62,5 μM, 250 μM e 500 μM padrão Pi às tiras de tubos em triplicado usando uma pipeta multicanal.
NOTA: A mistura de reação sem adição de Pi será usada como um branco. - Adicione 25 μL de solução composta às tiras de tubos usando uma pipeta multicanal.
NOTA: Cada composto tem três concentrações diferentes em triplicata, o que é suficiente para a estimativa inicial da metade da concentração inibitória máxima (IC50). Para uma determinação mais precisa do IC50, oito concentrações diferentes de compostos podem ser usadas. Para a enzima desinibida, a solução composta é substituída por igual quantidade de água. Como controles positivos foram utilizados 2,5 μM, 25 μM e 250 μM de sal de sódio imidodifosfato (IDP). - Adicione 15 μL de mistura de solução de mPPase (pirofosfatase ligada à membrana) às tiras de tubos (exceto para os tubos contendo o padrão Pi) usando uma pipeta multicanal.
- Sele as tiras de tubos com uma folha de vedação adesiva. Corte a folha de vedação para separar cada tira de tubo.
- Pré-incubar as amostras durante 5 min a 71 °C. Colocar as amostras no bloco de aquecimento com um intervalo de 20 s entre cada tira para minimizar o consumo de tempo durante os passos subsequentes.
- Para cada tira, abra a vedação adesiva. Adicionar 10 μL de pirofosfato de sódio dibásico a 2 mM utilizando uma pipeta multicanal e misturar pipetando para cima e para baixo durante 5×. Sele a tira de tubo novamente usando a mesma vedação.
NOTA: Esta etapa pode ser inicialmente difícil de realizar em 20 s; no entanto, ficará mais fácil após alguns ensaios. - Incubar a 71 °C durante 5 min.
- Colocar as amostras no aparelho de arrefecimento com um intervalo de 20 s entre cada tira. Deixe esfriar por 10 minutos, mas centrifugue cada tira brevemente após 5 minutos de resfriamento, para decantar gotas de água sob a folha de vedação, depois coloque-a de volta no aparelho de resfriamento e remova a vedação.
NOTA: O aparelho de resfriamento pode ser feito simplesmente colocando uma placa PCR (reação em cadeia da polimerase) de 96 poços em uma placa de Petri de poliestireno (tamanho 150 mm × 15 mm) cheia de água e congelada por pelo menos 1 h. O aparelho deve ser retirado do freezer cerca de 5 minutos antes do início do ensaio. Não retire o aparelho de resfriamento logo antes do resfriamento da amostra, pois isso congelará a mistura de reação e impedirá o desenvolvimento da cor. - Após 10 min de resfriamento, adicione 60 μL de solução A + B, misture pipetando para cima e para baixo por 5× e mantenha as tiras de tubos no aparelho de resfriamento por 10 min.
- Adicione 90 μL da solução de arsenito-citrato e mantenha em temperatura ambiente por pelo menos 30 min para produzir uma cor azul estável.
CUIDADO: Devido à sua toxicidade, todas as soluções que contenham arsenito de sódio devem ser manuseadas com cuidado extra em todos os momentos. Assim, a adição de solução de arsenito-citrato deve ser feita em uma capela de exaustão. - Dispense 180 μL de cada mistura de reação em uma microplaca de poliestireno transparente de 96 poços.
- Medir a absorvância de cada alvéolo a 860 nm utilizando um espectrofotómetro de microplacas.
