Visualização de proteínas de germinação na membrana interna de esporos bacterianos

Resumo

Fonte: Wen, J., Pasman, et. al., Visualização de germinossomos e membrana interna em esporos de Bacillus subtilis . J. Vis. (2019)

Este vídeo demonstra o uso de microscopia de iluminação estruturada para adquirir imagens de fluorescência tridimensionais que revelam a organização das proteínas de germinação dentro do esporo bacteriano.

Protocolo

1. Imagem de proteína de germinação (tempo: 1 h)
   1. Capture as imagens de transmissão e fluorescência de esporos, bem como uma mistura de microesferas fluorescentes modificadas com carboxilato vermelho e amarelo-verde em um Microscópio de Iluminação Estruturada (consulte a Tabela de materiais) equipado com uma objetiva de óleo de 100x (Abertura Numérica = 1,49), uma câmera CCD (Charge-Coupled Device) e software de análise de imagem (consulte a Tabela de materiais). Gere todas as imagens à temperatura ambiente sem a perturbação da luz ambiente. Certifique-se de sempre limpar a objetiva 100x e a lâmina com etanol 75% antes de fazer a imagem.
   2. Concentre-se em microesferas fluorescentes de 100 nm (diâmetro) e otimize a função de propagação de pontos (psf) ajustando o anel de correção na objetiva de 100x até obter um psf simétrico, minimizando assim o desfoque da imagem. O psf é a resposta ao impulso ou a resposta de um sistema de imagem a uma fonte pontual ou objeto pontual.
   3. Selecione um campo de visão com aproximadamente 10 microesferas fluorescentes redondas. Aplique um ajuste de foco de grade para comprimentos de onda de excitação de 561 nm e 488 nm como guia para o software de análise de imagem.
   4. Foque os esporos com a luz de transmissão e capture uma imagem de luz de transmissão no modo médio de 16× com exposições de 200 ms para cada imagem.
   5. Capture imagens fluorescentes brutas 3D-SIM dos esporos com o modo de iluminação "3D-SIM", as configurações da câmera para o modo de leitura Electron Multipling (EM) Gain 10MHz em 14 bits e ganho EM em 175. Excite a sonda FM4-64 em esporos PS4150 com luz laser de 561 nm a 20% de potência do laser e um tempo de iluminação de 400 ms.
   6. Excite o GerKB-mCherry e o GerD-GFP em esporos KGB80 com, respectivamente, luz laser de 561 nm a 30% de potência do laser por 1 s e luz laser de 488 nm a 60% da potência do laser por 3 s. As configurações do Z-Stack estão no modo de cima para baixo, 0,2 μm/passo.
      NOTA: Esses parâmetros de laser foram aplicados para garantir um valor máximo de brilho de cerca de 4.000 para a janela do histograma.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Corrediças de vidro secas ao ar	Menzel Gläser	630-2870
APO TIRF N20R8 100× objetiva de óleo (NA=1,49)
Bacillus subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
Bacillus subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Microesferas modificadas com carboxilato FluoSpheres	Invitrogen, 0,1 μm	Rolamento F8803
FM4-64	Thermo Fisher Científico	Rolamento F34653
Histodenz meio gradiente de densidade não iônica	Sigma-Aldrich	D2158
Imagem J
Câmera CCD iXON3 DU-897 X-6515	Tecnologia Andor		https://imagej.net/Welcome
Software de imagem microscópica	Nikon, Japão	Elemento NIS AR 4.51.01
Água desmineralizada ultrapura MilliQ	Millipore	Milli-Q IQ 7003
Microscópio Nikon Eclipse Ti
Lamínulas de Precisão	Paulo Marienfeld	117650
Tubos com tampa de rosca 50 mL	Thermo Fisher Científico		Nunc TM