Transfecção de ameba selvagem via eletroporação com suporte alimentar bacteriano

Resumo

Fonte: Paschke, P., et al. Engenharia genética de células de Dictyostelium discoideum com base na seleção e crescimento de bactérias. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra o procedimento para introduzir um plasmídeo que transporta um gene alvo nas células da ameba por meio de eletroporação, seguido de recuperação em um suplemento bacteriano para permitir a entrega eficiente do gene na ameba do tipo selvagem.

Protocolo

1. Configurando células de Dictyostelium para transfecção
   1. Cultive Klebsiella aerogenes até a confluência em meio SM (leite desnatado) (meio rico em nutrientes) durante a noite em RT (temperatura ambiente). As culturas podem ser armazenadas por até 2 semanas a 4 °C.
   2. Adicione cerca de 400 μL desta suspensão bacteriana em uma placa de ágar SM (peptona 10 g/L; extrato de levedura 1 g/L; glicose 10 g/L; KH₂PO₄ 1,9 g/L; K₂HPO₄ x 3 H₂O, 1,3 g/L; MgSO₄ anidro 0,49 g/L; 1,7% de ágar) e espalhadas uniformemente. Faça uma alça estéril e inocule com células de Dictyostelium . Espalhe as células em uma borda da placa.
   3. Incubar a placa a 22 °C durante 2 dias para garantir zonas de crescimento suficientemente grandes para a transfecção.
      NOTA: Para cepas de Dictyostelium que não criam grandes zonas de crescimento (por exemplo, Ax3, DH1 ou JH10), ou para experimentadores inexperientes, use placas de limpeza.
   4. Faça uma alça estéril e inocule com células de Dictyostelium (aproximadamente 2-4 x 10⁵ células). Transfira as células para 800 μL de uma suspensão densa de K. aerogenes em SM. Misture as células pipetando para cima e para baixo.
   5. Transfira 400 μL, 200 μL, 100 μL e 50 μL em placas de ágar SM frescas. Adicione a cada placa 400 μL de suspensão adicional de SM K. aerogenes , espalhe uniformemente e seque.
   6. Incubar as placas a 22 °C durante cerca de 2 dias até que estas se tornem translúcidas.
      NOTA: Devido à sua taxa de crescimento mais rápida, as bactérias inicialmente produzem um gramado confluente e as amebas subsequentemente "limpam" o prato das bactérias. O tempo necessário para esse processo pode diferir dependendo do histórico da cepa e da capacidade das células mutantes de crescer em bactérias.

2. Transfecção de células de dictiostelio com base na seleção bacteriana

1. Para preparar placas com suspensão de K. aerogenes , adicione 10 mL de tampão SorMC contendo bactérias K. aerogenes a uma densidade de OD (densidade óptica) ₆₀₀ = 2 (adicione 200 μL da solução estoque preparada OD₆₀₀ = 100 K. aerogenes para a concentração desejada de bactérias) em uma placa de Petri tratada com cultura de tecidos de 10 cm.
   NOTA: Esta placa é posteriormente necessária para cultivar as células transfectadas de D. discoideum . Alternativamente, uma placa de cultura de tecidos de 6 poços pode ser usada. No caso de transfecção dos plasmídeos extracromossômicos, a placa de cultura de tecidos de 6 poços é mais eficiente em termos de recursos. Use 2 mL de suspensão de K. aerogenes SorMC (OD₆₀₀ = 2) por poço.
2. Preparação de células de Dictyostelium
   1. Usando uma alça de inoculação descartável de 10 μL, raspe as células das zonas de crescimento (aproximadamente 3 cm) da placa de cultura (borda da área limpa) ou placa de limpeza. Transfira as células para um tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de tampão H40 gelado.
      NOTA: O momento da colheita de células de placas de limpeza é crucial. A colheita muito cedo produz uma quantidade muito pequena de células, enquanto a colheita tardia aumenta o risco de produzir células parcialmente desenvolvidas.
   2. Lave as células girando para baixo por 2 min a 1.000 x g ou girando rapidamente por 2 s a 10.000 x g. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em tampão H40 até uma densidade final de 2-4 x 10⁷ células/ml. Mantenha as células frias durante todo o procedimento de transfecção. Use uma pasta de água gelada para garantir o contato direto dos tubos e do gelo.
3. Eletroporação
   1. Adicione 100 μL de células a um tubo com 1-2 μg de DNA (ácido desoxirribonucléico). Misture com cuidado, pipetando para cima e para baixo.
   2. Transferir a mistura célula/ADN para uma cubeta de electroporação pré-arrefecida (intervalo de 2 mm).
   3. Pulse as células usando as seguintes configurações de onda quadrada: 350 V, 8 ms, 2 pulsos e intervalo de pulso de 1 s.
      NOTA: Não adicione mais de 2 μg de DNA. Quantidades maiores são tóxicas para as células e diminuem a eficiência da transfecção. O volume total de DNA adicionado não deve exceder 5 μL.
   4. Transfira as células imediatamente para a placa de Petri de 10 cm preparada anteriormente com K. aerogenes SorMC e permita que as células se recuperem por 5 h.
      NOTA: Verifique as células na placa de Petri sob um microscópio invertido. As células aparecerão redondas logo após a eletroporação, mas retornarão à sua forma amebóide após cerca de 30 minutos, quando tiverem tido tempo suficiente para se fixarem adequadamente à superfície.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microcentrífugas Eppendorf 5424/5424R	ThermoScientific	05-400-002
Centrífugas Eppendorf 5702R com rotor modelo A-4-38	ThermoScientific	12823252
Armário de segurança Foruna - SCANLAF	Labogene
Biofotômetro Plus	Eppendorf
CLSM 710	Zeiss
Ágar purificado	Oxóide	LP0028
Caldo SM	Para médio	SMB0102
2x LB caldo	Para médio	LBD0102
Ácido livre de HEPES	Sigma Aldrich/Merck	391340 EMD
KH₂PO₄	VWR	Pág. 4800/53
Na₂HPO₄ 2H₂O	VWR	10028-24-7
MgCl₂ 6H₂O	Sigma Aldrich/Merck	5982 EMD
CaCl₂ 2H₂O	Sigma Aldrich	442909
Ácido fólico	Sigma Aldrich	F7876
KOH	VWR	26668.263
Prato de cultura de tecidos estilo 100 x 20 mm, tratamento de cultura de tecidos	Corning Incorporada	353003
Cuvetes de eletroporação de 2 mm, eletrodo longo	Fluxo Genérico Limitado	E6-0062
10 μl de alça de inoculação, azul 10 micro l	ThermoScientific	129399
Espalhador, em forma de L, estéril	Greiner Bio-One	730190