Visualização de interações bacterianas unicelulares

Resumo

Fonte: Yarringto, K. D., et al. Visualização cinética de interações bacterianas interespécies de célula única. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a preparação de um sistema de cocultura usando bactérias móveis e não móveis sob uma almofada de agarose para imagens de células vivas. Ele mostra como bactérias móveis detectam atrativos químicos e invadem colônias imóveis, revelando interações bacterianas.

Protocolo

1. Preparação de células bacterianas e almofadas inoculantes

1. Meça a densidade óptica, OD₆₀₀, de cada subcultura e dilua Pseudomonas aeruginosa para um OD₆₀₀ = 0,03 e Staphylococcus aureus para um OD₆₀₀ = 0,10 em M8T (Meio Mínimo 8 + triptona) pré-aquecido a 37 ° C. Misture P. aeruginosa e S. aureus em uma proporção de 1: 1 e vórtice.
   NOTA: Se as cepas exigirem antibióticos, elas podem ser adicionadas à noite e à subcultura, mas não devem ser adicionadas ao misturar espécies para imagens se afetarem as outras espécies na cocultura. A estabilidade do plasmídeo e os efeitos dos antibióticos em todas as espécies na cocultura precisarão ser determinados para cada organismo / plasmídeo usado.
2. Pipetar 1 μL de cocultura uniformemente no fundo de uma lamínula de vidro pré-aquecida e estéril de 35 mm.
3. Remova o recorte de silicone do molde usando uma pinça estéril.
4. Remova a almofada do prato usando espátulas estéreis.
   1. Deslize a espátula ligeiramente dobrada sob a borda da almofada enquanto segura o molde de cabeça para baixo para soltá-lo em uma tampa estéril da placa de Petri.
      NOTA: Não force a almofada para fora, ou ela rasgará. Acompanhe qual lado da almofada é a parte inferior.
5. Transfira a almofada para o prato com as células bacterianas, com o lado inferior para baixo, deslizando a espátula em ângulo de 90° sob a almofada e colocando-a em cima da lamínula inoculada. Use a espátula angular de 90° para nivelar a almofada contra a lamínula e pressione suavemente as bolhas de ar.
6. Remova o excesso de umidade dos lenços umedecidos e coloque-os ao redor da borda do prato, certificando-se de que não toquem na almofada. A amostra agora está pronta para geração de imagens.

Materiais