Enriquecimento de lipoproteínas bacterianas usando separação de fases de detergente não iônico

Resumo

Fonte: Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Enriquecimento de Lipoproteínas Bacterianas e Preparação de Lipopeptídeos N-terminais para Determinação Estrutural por Espectrometria de Massa. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o enriquecimento de lipoproteínas bacterianas usando um detergente não iônico que sofre separação de fases após o aquecimento. Por meio de mudanças sequenciais de temperatura e etapas de centrifugação, as lipoproteínas são seletivamente divididas na fase detergente, enquanto os contaminantes não lipoproteicos são removidos. As lipoproteínas enriquecidas são então precipitadas, lavadas e ressuspensas para aplicações a jusante.

Protocolo

1. Enriquecimento de lipoproteínas por particionamento de fase Triton X-114 (TX-114)

1. Suplementar o lisado bacteriano com surfactante TX-114 até uma concentração final de 2% (vol/vol) adicionando um volume igual de surfactante a 4% (vol/vol) em solução salina gelada Tamponada com Tris/ácido etilenodiaminotetracético (TBSE) e incubar em gelo por 1 h, misturando por inversão a cada ~15 min.
   NOTA: Quando resfriados, o sobrenadante e o surfactante serão miscíveis.
2. Transfira o tubo para um banho-maria a 37 °C e incube por 10 min para induzir a separação de fases. Centrifugue a amostra a 10.000 x g por 10 min em temperatura ambiente para manter a separação bifásica.
3. Pipetar suavemente a fase aquosa superior e eliminar. Adicione TBSE gelado à fase inferior do surfactante para reabastecer o tubo ao seu volume original e invertê-lo para misturar. Incube no gelo por 10 min.
4. Transfira o tubo para um banho-maria a 37 °C e incube por 10 min para induzir a separação de fases, depois centrifugue a 10.000 x g por 10 min em temperatura ambiente.
5. Repita as etapas 1.3-1.4 mais uma vez para um total de 3 separações. Remova a fase aquosa superior e descarte.
6. Remova o pellet de proteínas precipitadas que se formaram durante o curso das extrações (visíveis no fundo do tubo), adicionando 1 volume de TBSE gelado à fase surfactante. Centrifugue a 4 °C a 16.000 x g por 2 min para granular proteína insolúvel.
   NOTA: A amostra deve permanecer uma única fase. Se ocorrer separação de fases, resfrie novamente a amostra e centrifugue novamente. O pellet é geralmente composto de contaminantes não lipoproteicos, mas pode ser retido para análise posterior.
7. Transfira imediatamente o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 2,0 mL contendo 1250 μL de acetona a 100%. Pipete para cima e para baixo completamente para lavar a amostra da ponta, pois ela ficará viscosa. Misturar por inversão e incubar durante a noite a -20 °C para precipitar a proteína.
8. Centrifugue a amostra a 16.000 x g por 20 min em temperatura ambiente para pellet lipoproteínas com atenção à orientação do tubo. As lipoproteínas formarão uma película fina e branca ao longo da parede externa do tubo.
9. Lave o pellet duas vezes com 100% de acetona. Transvase a acetona e deixe a amostra secar ao ar.
10. Adicione 20-40 μL de cloridrato de Tris 10 mM, pH 8,0 ou um tampão de amostra Laemmli SDS-PAGE padrão e ressuspenda completamente pipetando para cima e para baixo contra a parede com as lipoproteínas precipitadas. Raspe a lateral do tubo com a ponta da pipeta para desalojar as lipoproteínas.
    NOTA: As lipoproteínas não se dissolvem no tampão Tris, mas formam uma suspensão.
    1. Armazene as lipoproteínas a -20 °C até o uso.

Materiais