Purificação de proteínas de domínio P recombinante derivadas de bactérias de norovírus humano

Resumo

Fonte: Leuthold, M. M., et al. Produção de Domínios Salientes de Norovírus Humano em E. coli para Cristalografia de Raios-X. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra a purificação do domínio P do norovírus humano recombinante usando cromatografia de exclusão de tamanho, destacando a separação da proteína-alvo de impurezas de maior e menor peso molecular com base na acessibilidade diferencial dos poros. O processo é monitorado por absorbância UV e confirmado por meio da análise SDS-PAGE de frações eluídas.

Protocolo

1. 3ª Etapa de Purificação

1. Lave as bombas e tubos do sistema de purificação HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência) e pré-equilibre a coluna SEC (cromatografia de exclusão de tamanho) (consulte a Lista de Materiais) com GFB (tampão de filtração em gel).
2. Injetar o domínio P na coluna a um débito de 1 ml/min utilizando um superloop (até 12 ml) ou um loop (até 3 ml), dependendo do volume da amostra concentrada. Após o término da injeção, aumente a taxa de fluxo para 2,5 ml/min.
3. À medida que o OD (densidade óptica) aumenta e o domínio P sai da coluna, colete frações de 1,5 ml. Verifique as frações usando SDS-PAGE com um gel a 12% (Figura 1A e 1B). Agrupar apenas as fracções mais puras e concentrar a ~ 3 mg/ml e ~ 8 mg/ml.
   Nota: Após ~ 110 ml (volume vazio), a maioria das impurezas é eluída de uma coluna SEC com 320 ml de volume de leito. O domínio P é geralmente eluído como um dímero. O tempo/volume de eluição do dímero do domínio P depende do grau de preparação (pg) da coluna SEC.

Resultados

Figura 1. Resultados esquemáticos e representativos para a 3ª etapa de purificação.
Cromatograma de eluição do domínio P usando SEC e resultado SDS-PAGE correspondente. Os números pretos indicam as frações coletadas. A) E...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DNA do domínio P	Tecnologias da Vida		Síntese de genes GeneArt
Vivaspin 20	GE Saúde	vário	corte de 10 kDa, 30 kDa e 50 kDa utilizados
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Saúde	28-9893-34	Coluna SEC