Purificação seletiva de uma proteína bacteriana por cromatografia de troca iônica negativa

Resumo

Fonte: Kuo, T., et al. Purificação cromatográfica negativa em uma etapa da proteína ativadora de neutrófilos Helicobacter pylori superexpressa em Escherichia coli em modo de batelada. J. Vis. Exp. (2016)

O vídeo demonstra uma técnica de cromatografia negativa para purificar uma proteína associada à virulência de um lisado bacteriano. Ao usar uma resina carregada positivamente em uma solução tamponada, as proteínas da célula hospedeira são retidas seletivamente, enquanto a proteína-alvo quase neutra permanece não ligada e é coletada no fluxo. Este método permite a separação e recuperação eficientes da proteína alvo para aplicações a jusante.

Protocolo

1. Expressão de HP-NAP recombinante em Escherichia coli (E. coli)

1. Preparar o plasmídeo pET42a-NAP que contém a sequência de ADN da proteína activadora de neutrófilos de Helicobacter pylori (HP-NAP) da estirpe H. pylori 26695, tal como descrito anteriormente. Preparar os plasmídeos que contêm a sequência de ADN da HP-NAP com as mutações pontuais desejadas.
2. Transformar 10 ng dos plasmídeos de ADN acima referidos em células competentes para E. coli BL21 (DE3) por choque térmico durante 45 segundos a 42 °C, riscar as células em placas de ágar caldo de lisogenia (LB) contendo 50 μg/ml de canamicina e incubar as placas a 37 °C durante 16 horas.
3. Inocular colónias individuais em tubos individuais contendo 5 ml de caldo LB com 50 μg/ml de canamicina e cultivá-las como pré-culturas a 37 °C durante 16 horas com agitação a 170 rpm.
4. Inocular 2 ml das células de pré-cultura acima referidas em 200 ml de caldo LB contendo 50 μg/ml de canamicina num balão de 1 litro. Incubar o balão de cultura inoculado a 37 °C durante 2 horas, agitando a 170 rpm até que a absorvância a 600 nm atinja aproximadamente 0,4-0,5 detectada por um espectrofotómetro ultravioleta visível (UV/VIS).
5. Adicionar 80 μl de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo 1 M (IPTG) na cultura acima referida até uma concentração final de 0,4 mM para induzir a expressão de HP-NAP. Incubar a cultura durante 3 horas até que a absorvância a 600 nm atinja aproximadamente 1,6-1,7.
6. Centrifugue as células a 6.000 x g a 4 °C por 15 min para remover o sobrenadante. Armazene o pellet celular a -70 °C até a purificação.

2. Preparação da fracção proteica solúvel contendo HP-NAP

NOTA: Todas as etapas a seguir são executadas a 4 °C.

1. Ressuspenda 50 ml do pellet celular preparado na etapa 1.6 do protocolo em 20 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 9,0, NaCl 50 mM contendo fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,13 mM, N-alfa-tosil-L-lisinil-clorometilcetona (TLCK) e N-tosil-L-fenilalaninil-clorometilcetona (TPCK) 0,03 mM a 4 °C conforme descrito anteriormente.
2. Interrompa as células bacterianas passando a suspensão bacteriana por um homogeneizador de alta pressão operado em uma faixa de 15.000 a 20.000 psi por 7 vezes a 4 °C.
3. Centrifugar o lisado celular a 30.000 × g a 4 °C durante 1 hora para separar as fracções de proteínas solúveis e insolúveis utilizando uma ultracentrífuga. Transferir o sobrenadante como fracção proteica solúvel para um copo.
4. Medir a concentração proteica da fração proteica solúvel pelo método de Bradford, utilizando um kit comercial com albumina de soro bovino (BSA) como padrão, de acordo com as instruções do fabricante.
5. Adicione 177,6 μl de HCl 1 N em 20 ml da fração de proteína solúvel obtida na etapa 2.3 do protocolo para ajustar seu valor de pH de pH de pH 9,0 a pH 8,0.
6. Adicione 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de NaCl à solução proteica acima para perfazer a concentração final de proteína de 0,5 mg/ml.

3. Purificação de HP-NAP recombinante de E. coli por cromatografia em lote de modo negativo com resinas de troca iônica DEAE

1. Preparar 15 ml de resinas de dietilaminoetilo (DEAE).
   1. Pesar 0,6 g de pó seco de resinas DEAE e suspendê-lo em 30 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM à temperatura ambiente durante pelo menos 1 dia.
   2. Centrifugue a resina a 10.000 x g a 4 °C por 1 min.
   3. Remova e descarte o sobrenadante.
   4. Adicionar 15 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM.
   5. Repita as etapas de protocolo 3.1.2 a 3.1.4 mais quatro vezes.
   6. Conservar a resina sedimentada de 15 ml (50% de pasta em tampão Tris de 30 ml) a 4 °C para utilização posterior.
      NOTA: Todas as etapas a seguir são executadas a 4 °C.
2. Adicionar 45 ml das proteínas solúveis preparadas na etapa 2.6 do protocolo a 15 ml da resina e agitar a pasta de proteínas/resina com um agitador magnético a 4 °C durante 1 hora.
3. Despeje a pasta de proteína/resina em uma coluna de plástico ou vidro equipada com uma torneira. Deixe a resina assentar sob a gravidade.
4. Abra a torneira para permitir que a solução de proteína escorra através da coluna por fluxo de gravidade até que o nível de líquido na coluna esteja um pouco acima da resina. Colete o fluxo como a fração não ligada, que contém o HP-NAP purificado.
5. Adicionar 15 ml de Tris-HCl 20 mM gelado, pH 8,0, NaCl 50 mM na coluna.
6. Abra a torneira para permitir que o tampão de lavagem percorra a coluna por fluxo por gravidade até que o nível do líquido na coluna esteja logo acima da resina. Colete o fluxo como a fração de lavagem.
7. Repita as etapas 3.5 a 3.6 do protocolo mais quatro vezes para coletar as frações de lavagem adicionais.

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