Um procedimento para a purificação de uma proteína marcada com poli-histidina de Streptococcus mutans

Resumo

Fonte: Murata, T., et al. Purificação de uma proteína de alta massa molecular em Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra um procedimento passo a passo para a purificação de uma proteína marcada com poli-histidina secretada por Streptococcus mutans.

Protocolo

1. Concentrar as proteínas do sobrenadante da cultura por precipitação de sulfato de amónio.
   NOTA: Extrato de corpos celulares se uma proteína-alvo for intracelular.
   1. Centrifugar a suspensão de cultura bacteriana (Streptococcus mutans) durante 20 min a 10.000 x g a 4 °C. Recuperar o sobrenadante da cultura para um copo de vidro de 3 l.
   2. Adicionar 1.122 g de sulfato de amónio a 2 l do sobrenadante (saturação a 80%) com agitação vigorosa com agitador magnético. Deixar o precipitado formar-se durante 4 h ou mais a 4 °C, agitando.
      NOTA: A formação do precipitado pode ser continuada durante a noite.
   3. Centrifugar a solução precipitada com sulfato de amónio a 15 000 x g durante 20 min a 4 °C. Transvasar o sobrenadante.
   4. Recolher o precipitado com uma espátula e transferir para um copo de vidro de 200 ml. Ressuspenda os pellets em 35 mL de tampão de ligação (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 5 mM imidazol, pH 8,0).
   5. Diálise da suspensão contra 2.500 ml do tampão de ligação utilizando um tubo de diálise de celulose regenerada, a 4 °C, com agitação. Substitua a solução de diálise após 2 h e continue a diálise durante a noite.
   6. Substitua novamente a solução de diálise. Continue a dialisar por mais 2 h.
2. Centrifugue a suspensão dialisada a 20.000 x g por 10 min a 4 °C. Filtre o sobrenadante através de um filtro de membrana usando equipamento de filtração por sucção. Transferir o filtrado para um balão de 75 cm² .
3. Fracionar a glicosiltransferase-SI (GTF-SI) marcada com poli-histidina da suspensão filtrada por cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC).
   1. Transferir 2 ml da pasta de resina IMAC carregada com Ni (cerca de 1 ml de resina) para uma coluna cromatográfica cuja saída está ligada a um tubo de silicone. Remova a solução de armazenamento pelo fluxo por gravidade.
      CUIDADO: Não permita que a resina seque durante o IMAC.
   2. Adicione 3 mL de água destilada na coluna para lavar a resina. Adicione 5 mL do tampão de ligação para equilibrar a resina.
   3. Desligue o fluxo com uma torneira de aperto Hoffmann. Adicione 5 mL da suspensão filtrada da etapa 2 para fazer a pasta.
   4. Adicione toda a pasta à suspensão filtrada restante. Agite a mistura suavemente por 30 min a 4 °C.
   5. Coloque a mistura de volta na coluna. Remova a suspensão pelo fluxo de gravidade. Lave a resina IMAC com 20 mL de tampão de ligação.
      NOTA: Ajuste a taxa de fluxo para aproximadamente 2 mL / min com uma torneira de aperto Hoffmann durante o IMAC subsequente.
   6. Eluir o GTF-SI recombinante com 20 ml do tampão de eluição (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 8,0).
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. O eluído deve ser armazenado a 4 °C. A resina IMAC pode ser reutilizada.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Unidade centrífuga de ultrafiltração	Sartorius	VS2032	Reposição de tampão e concentração de proteína
Centrifuga	Kubota	7780II
Coluna cromatográfica	Bio-Rad	7321010	Para IMAC
Pinça de membrana para diálise	Marca Fisher	21-153-100
Tubos para diálise	Como um só	2-316-06
Imidazol	Wako	095-00015	Preparação do tampão de ligação e do tampão de eluição
Incubadora	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	Ajuste de temperatura: 37 °C
Microcentrífuga	Kubota	3740
Cloreto de Sodim	Wako	191-01665	Preparação do tampão de ligação e do tampão de eluição
Dihidrogenofosfato de sódio di-hidratado	Wako	192-02815	Preparação do tampão de ligação e do tampão de eluição
Hidróxido de sódio	Wako	198-13765	Preparação do tampão de ligação e do tampão de eluição
Sulfato de amônio	Wako	015-06737	Precipitação de sulfato de amônio
Resina carregada com Ni	Bio-Rad	1560133	Para IMAC
Filtro de membrana	Merck Millipore	JGWP04700	0,2 μm de diâmetro