Um procedimento para a purificação de uma proteína marcada com poli-histidina de Streptococcus mutans

Resumo

Fonte: Murata, T., et al. Purificação de uma proteína de alta massa molecular em Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra um procedimento passo a passo para a purificação de uma proteína marcada com poli-histidina secretada por Streptococcus mutans.

Protocolo

1. Concentrar as proteínas do sobrenadante da cultura por precipitação de sulfato de amónio.
   NOTA: Extrato de corpos celulares se uma proteína-alvo for intracelular.
   1. Centrifugar a suspensão de cultura bacteriana (Streptococcus mutans) durante 20 min a 10.000 x g a 4 °C. Recuperar o sobrenadante da cultura para um copo de vidro de 3 l.
   2. Adicionar 1.122 g de sulfato de amónio a 2 l do sobrenadante (saturação a 80%) com agitação vigorosa com agitador magnético. Deixar o precipitado formar-se durante 4 h ou mais a 4 °C, agitando.
      NOTA: A formação do precipitado pode ser continuada durant....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Unidade centrífuga de ultrafiltração	Sartorius	VS2032	Reposição de tampão e concentração de proteína
Centrifuga	Kubota	7780II
Coluna cromatográfica	Bio-Rad	7321010	Para IMAC
Pinça de membrana para diálise	Marca Fisher	21-153-100
Tubos para diálise	Como um só	2-316-06
Imidazol	Wako	095-00015	Preparação do tampão de ligação e do tampão de eluição
Incubadora	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	Ajuste de temperatura: 37 °C
Microcentrífuga	Kubota	3740
Cloreto de Sodim	Wako	191-01665	Preparação do tampão de ligação e do tampão de eluição
Dihidrogenofosfato de sódio di-hidratado	Wako	192-02815	Preparação do tampão de ligação e do tampão de eluição
Hidróxido de sódio	Wako	198-13765	Preparação do tampão de ligação e do tampão de eluição
Sulfato de amônio	Wako	015-06737	Precipitação de sulfato de amônio
Resina carregada com Ni	Bio-Rad	1560133	Para IMAC
Filtro de membrana	Merck Millipore	JGWP04700	0,2 μm de diâmetro