Medindo a ligação do medicamento ao caseum de lesões de tuberculose por meio do método de diálise de equilíbrio rápido

Resumo

Fonte: Sarathy, J. P. et al. Um ensaio de ligação de caseum in vitro que prevê a penetração de drogas em lesões de tuberculose. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para medir a ligação do fármaco ao caseum de lesões de tuberculose usando diálise de equilíbrio rápido. Ele descreve as etapas para preparar suspensões de caseum, realizar diálise e calcular a fração de medicamento não ligada para prever a penetração do medicamento no caseum.

Protocolo

1. Ensaio de diálise de equilíbrio rápido (RED)

1. Crave 6,5 μL da solução de 500 μM do composto de teste em 643,5 μL do homogenato para atingir a concentração final de 5 μM (≤1% DMSO) e vórtice.
2. Coloque as inserções VERMELHAS na placa de base. Adicione 200 μL da matriz enriquecida com fármaco na câmara doadora (anel vermelho) de cada inserção RED e 350 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em cada câmara receptora. Prepare 3 inserções para cada composto de teste (amostras triplicadas). Selar a placa com uma placa adesiva e incubar a 37 °C no termomisturador a 200 rpm (1 x g) durante 4 h.
3. Após a incubação, misture suavemente o conteúdo das câmaras doadora e receptora pipetando para cima e para baixo 2-3 vezes. Pipetar alíquotas de 20 μL de homogenato das câmaras doadoras e adicionar 20 μL de PBS limpo em um tubo de 1,5 mL (1:1). Da mesma forma, pipetar alíquotas de 20 μL de amostras de PBS das câmaras receptoras e adicionar 20 μL de homogeneizado limpo (correspondência de matriz).
   NOTA: A correspondência de matrizes elimina a necessidade de 2 curvas de calibração separadas (em homogenato e PBS) para análise quantitativa. O conteúdo da câmara doadora pode sedimentar com o tempo. Misture delicadamente o conteúdo pipetando antes de remover as alíquotas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de base reutilizável do dispositivo Pierce RED	Fisher Científico	PI-89811
Inserções de Dispositivo Pierce RED, 50/caixa	Fisher Científico	PI-89809
Ferramenta de remoção de pastilhas Pierce RED	Fisher Científico	89812
Vedação de placa adesiva	Fisher Científico	08-408-240
PBS, pH 7,4, 10x 500 mL (Gibco)	Tecnologias da Vida	10010-049
DMSO	Sigma	472301