Microscopia microfluídica de lapso de tempo para estudar a persistência de antibióticos em bactérias

Abstract

Fonte: Oms, T., et al. População e análise de célula única da persistência de antibióticos em Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2023)

Este vídeo apresenta um protocolo para monitorar células bacterianas individuais que expressam uma proteína de ligação ao DNA marcada com fluorescência dentro de um sistema microfluídico. Ele ilustra como os antibióticos inibem a maioria das células, enquanto uma subpopulação de células persistentes sobrevive ao tratamento e cresce novamente após a remoção do antibiótico.

Protocol

Imagem microfluídica de microscopia de lapso de tempo

NOTA: A seção a seguir descreve a preparação da placa microfluídica, bem como o procedimento de aquisição e análise de imagem com lapso de tempo. O objetivo deste experimento é observar e analisar o fenótipo de persistência após o tratamento com antibióticos em nível de célula única. Os dados coletados durante este experimento podem ser usados para gerar uma ampla gama de resultados, dependendo da questão abordada e/ou dos repórteres fluorescentes usados durante o experimento. No experimento aqui descrito, foi realizada uma análise quantitativa do comprimento celular e da fluorescência de HU-mCherry, refletindo a organização nucleóide em células persistentes e não persistentes.

1. Cultura de células bacterianas para microscopia de lapso de tempo microfluídica
   1. Inocular 5 ml de glicerol (3-[N-morfolino] ácido propanossulfónico (MOPS) 0,4%, suplementado com um antibiótico selectivo, se necessário) com uma colónia isolada num tubo de vidro (≥25 ml) e colocar o tubo numa incubadora agitada regulada para 37 °C e 180 rpm durante a noite (entre 15 h e 19 h).
   2. No dia seguinte, medir a DO₆₀₀ nm e diluir a cultura em meio fresco ajustado à temperatura (37 °C, glicerol MOPS 0,4%) num tubo de vidro até uma DO_{final de 600} nm de ~0,001. Deixe a cultura crescer durante a noite (entre 15 h e 19 h) em uma incubadora agitada a 37 ° C e 180 rpm para obter uma cultura de fase exponencial inicial no dia seguinte.
2. Preparação da placa microfluídica e imagem de microscopia de lapso de tempo
   NOTA: Experimentos microfluídicos podem ser realizados em dispositivos microfluídicos disponíveis comercialmente (conforme descrito aqui) ou em sistemas microfluídicos produzidos internamente.
   1. Remova a solução de conservação (se houver) de cada poço da placa microfluídica e substitua-a por um meio de cultura fresco.
      NOTA: Se a placa microfluídica contiver um poço de saída de resíduos, a solução de conservação do poço de saída deve ser removida, mas não substituída pelo meio.
   2. Sele a placa microfluídica com o sistema manifold clicando no botão Seal ou através do software microfluídico (primeiro selecione Tool, seguido de Seal Plate).
      NOTA: Para selar a placa, uma pressão uniforme deve ser aplicada à placa e ao coletor, apertando manualmente a placa contra o coletor. Se executado corretamente, a nota "selada" deve aparecer na interface ONIX2. É importante não aplicar nenhuma pressão na corrediça de vidro para evitar qualquer risco potencial de quebrar o coletor.
   3. Uma vez selado, execute uma primeira sequência de escorva (clique em Executar sequência de escorva líquida na interface do software microfluídico).
      NOTA: A sequência de escorva líquida corresponde a 5 min de perfusão a 6,9 kPa para os poços 1-5, seguidos por 5 min de perfusão a 6,9 kPa para o poço 8 e uma rodada final de perfusão para o poço 6 por 5 min a 6,9 kPa. A Run Liquid Priming Sequence permite a remoção da solução de conservação que ainda pode estar presente nos canais que conectam os diferentes poços.
   4. Incubar a placa num armário do microscópio controlado por termostato à temperatura desejada (neste caso, 37 °C) durante um mínimo de 2 h antes do início da imagem microscópica.
   5. Inicie uma segunda Sequência de Preparação Líquida de Execução antes de iniciar o experimento.
   6. Sele a placa microfluídica clicando em Selar na interface do software microfluídico. Substitua o meio no poço 1 e no poço 2 por 200 μL de meio fresco, no poço 3 por 200 μL de meio fresco contendo o antibiótico (aqui, ofloxacina (OFX) a 5 μg·mL⁻¹), no poço 4 e no poço 5 por 200 μL de meio fresco, no poço 6 por 200 μL de meio fresco, e no poço 8 com 200 μL da amostra de cultura (da etapa 1.2) diluída a uma DO₆₀₀ nm de 0,01 no meio fresco.
   7. Sele a placa microfluídica conforme descrito na etapa 2.2 e coloque-a na objetiva do microscópio dentro do gabinete do microscópio.
      NOTA: Certifique-se de colocar uma gota de óleo de imersão na objetiva do microscópio antes de colocar a placa microfluídica.
   8. No software microfluídico, clique em Cell Loading para permitir o carregamento da célula na placa microfluídica.
      NOTA: A etapa de carregamento celular compreende 15 s de perfusão a 13,8 kPa para o poço 8, seguido por 15 s de perfusão a 27,6 kPa para o poço 6 e poço 8, e uma rodada final de perfusão para o poço 6 por 30 s a 6,9 kPa. A densidade das células na placa microfluídica é crítica para o experimento. A primeira parte deste protocolo microfluídico consiste no cultivo de bactérias por 6 h em meio fresco antes do tratamento com antibióticos. Após 6 h de crescimento, a densidade celular deve ser suficiente para detectar as raras células persistentes (nas condições usadas neste estudo, as células persistentes são geradas a uma frequência de 10⁻⁴). Se a densidade celular for muito alta, é difícil distinguir as células individuais, o que impede a análise precisa de uma única célula. Uma vez que a taxa de crescimento depende directamente do meio, a densidade das células nos campos de microscopia deve ser avaliada antes do lançamento da experiência.
   9. Defina um foco ideal usando o modo de luz transmitida e selecione várias regiões de interesse (ROIs) onde um número de células apropriado é observado (até 300 células por campo).
      NOTA: Selecione pelo menos 40 ROIs para garantir que as células persistentes raras sejam visualizadas.
   10. No software microfluídico, clique em Criar um protocolo. Programe a injeção de meio fresco a 6,9 kPa por 6 h (poço 1-2), seguida pela injeção do meio contendo o antibiótico a 6,9 kPa por 6 h (poço 3) e, finalmente, a injeção de meio fresco a 6,9 kPa por 20 h (poços 4-5).
       NOTA: Uma cultura bacteriana diluída a uma DO_{de 600} nm de 0,01 permite que as bactérias cresçam na câmara microfluídica por 6 h, garantindo que as células estejam na fase de crescimento exponencial. Dependendo do número de células introduzidas no dispositivo microfluídico durante a etapa de carregamento (consulte a etapa 2.8), a duração da fase de crescimento pode ser adaptada para obter até 300 células por ROI. Como a persistência é um fenômeno raro, o aumento do número de células por ROI melhora a possibilidade de observar células persistentes. O número de células não deve, no entanto, exceder 300 células por ROI, pois isso torna a análise de célula única tediosa.
   11. Realize imagens de microscopia no modo de lapso de tempo com um quadro a cada 15 minutos usando luz transmitida e a fonte de luz de excitação para o repórter fluorescente. Aqui, foi utilizada uma fonte de luz de excitação de 560 nm para o sinal mCherry (LED de 580 nm a 10% de potência com filtro 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] e exposição de 100 ms para mCherry). O software Zen3.2 compatível com Zeiss foi usado para imagens de células.
3. Análise de imagem
   NOTA: A abertura e visualização das imagens de microscopia são realizadas com o software de código aberto ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/). A análise quantitativa da imagem é realizada usando o software de código aberto ImageJ/Fiji e o plug-in gratuito MicrobeJ (https://microbej.com). Nesse protocolo, foi utilizada a versão MicrobeJ 5.13I(14).
   1. Abra o software ImageJ/Fiji no computador e arraste as imagens de microscopia de lapso de tempo hyperstack para a barra de carregamento de Fiji. Use Imagem > Cor > Criar Composto para fundir os diferentes canais do hyperstack. Se os canais do experimento de lapso de tempo não corresponderem à cor desejada (por exemplo, o contraste de fase é mostrado em vermelho em vez de cinza), use Imagem > Cor > Organizar Canais para aplicar a cor apropriada aos canais.
   2. Abra o plug-in MicrobeJ e detecte as células bacterianas usando a interface de edição manual. Exclua as células detectadas automaticamente e contorne manualmente as células persistentes de interesse quadro a quadro.
      NOTA: Diferentes configurações podem ser usadas para detectar automaticamente células individuais. A detecção manual foi usada aqui, pois as células persistentes analisadas formam filamentos longos, que raramente são detectados corretamente usando a detecção automática.
   3. Após a detecção, use o ícone Resultado na interface de edição manual do MicrobeJ para gerar uma tabela ResultJ. Salve o arquivo ResultJ e use-o para obter insights sobre diferentes parâmetros de interesse na análise de célula única. Neste protocolo, a fluorescência média da intensidade HU-mCherry, o comprimento celular e a área celular de células individuais foram exportados.

Materials