Triagem de moduladores cíclicos de di-GMP usando bactérias que expressam uma proteína repórter fluorescente

Abstract

Fonte: Rugjee, K. N., et al. Estabelecimento de uma configuração de alto rendimento para triagem de pequenas moléculas que modulam a sinalização c-di-GMP em Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra a triagem de moduladores cíclicos de di-GMP usando bactérias geneticamente modificadas que expressam proteína fluorescente verde (GFP) sob o controle de um promotor sensível a c-di-GMP. A fluorescência é medida em uma placa de vários poços contendo diferentes compostos de teste. Compostos que inibem a produção de c-di-GMP levam à redução da fluorescência. Os dados são então analisados para identificar potenciais moduladores da sinalização c-di-GMP em bactérias.

Protocol

1. Geração de Proteína Fluorescente Verde (GFP) Tagged di-GMP cíclico (c-di-GMP) Repórter Cepa Pseudomonas aeruginosa

1. Inocular 5 ml de meio de caldo de lisogenia (LB) com uma única colónia de P. aeruginosa e incubar durante a noite a 37 °C com agitação a 200 rpm.
2. Transferir 2 ml da cultura durante a noite para 200 ml de meio LB fresco num balão de 1 L e incubar a 37 °C, agitando a 200 rpm.
3. Monitorizar a densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) de 30 em 30 minutos, retirando uma amostra de 1 ml do balão e examinando-a com um espectrofotómetro.
4. Quando o OD₆₀₀ atingir entre 0,3 - 0,5, coloque 40 ml da cultura em um tubo de centrífuga cônico de 50 ml.
5. Pulverizar as células centrifugando a 8.000 rpm durante 10 min a 4 °C, rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 40 ml de solução gelada, estéril e de sacarose a 300 mM.
6. Pulverizar as células uma segunda vez centrifugando conforme descrito no passo 1.5 e ressuspender em 20 ml de solução de sacarose 300 mM gelada, estéril.
7. Pulverizar as células uma última vez centrifugando conforme descrito no passo 1.5 e ressuspender em 400 μl de solução de sacarose gelada, estéril e a 300 mM.
   Nota: A densidade celular neste ponto deve ser de aproximadamente 1 x 10¹¹ unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/ml).
8. Refrigere as células no gelo por 30 min, após o qual elas estão prontas para eletroporação.
9. Adicionar 1 μl de uma solução plasmídica de 0,2 μg/μl pCdrA::gfp^C a 40 μl de células eletrocompetentes de P. aeruginosa preparadas acima num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml pré-arrefecido em gelo. Misture a suspensão e transfira-a para uma cubeta de eletroporação pré-resfriada de 2 mm.
10. Remova a umidade do lado de fora da cubeta com papel de seda e coloque a cubeta na câmara de amostra do eletroporador. Pulso com tensão de 2,5 kV, capacitância de 25 μF e resistência de 200 Ω.
11. Retire a cubeta e adicione 1 ml de LB de meio. Em seguida, transfira as células para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml e incube por 2 horas a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
12. Espalhe alíquotas de 10 μl, 50 μl e 100 μl da cultura em placas estéreis de ágar LB suplementadas com ampicilina (a uma concentração de 100 μg / ml) e incube as placas a 37 ° C durante a noite.
13. Confirme a expressão de GFP (excitação a 485 nm, emissão a 520 nm) examinando a placa sob um microscópio de fluorescência com um canal GFP padrão e escolha uma única colônia para inocular 5 mL LB. Incubar durante a noite, conforme descrito na etapa 1.1. Misture 0,5 ml da cultura noturna com 0,5 ml de glicerol a 50% em um tubo com tampa de rosca de 2 ml e armazene a -80 °C.

2. Preparação da cultura inicial para inoculação

1. Dois dias antes do rastreio, colocar a estirpe de P. aeruginosa (contendo o plasmídeo pCdrA::gfp^C ) do stock de -80 °C numa placa de ágar LB (suplementada com ampicilina a uma concentração de 100 μg/ml), espalhando suavemente a bactéria sobre a placa utilizando uma alça de inoculação estéril. Incubar a placa durante a noite a 37 °C.
2. Na noite anterior à triagem, inocular uma única colônia de P. aeruginosa da placa em 10 ml de meio LB (suplementado com ampicilina na concentração de 100 μg/ml) em um tubo e incubar a pré-cultura durante a noite a 37 ° C com agitação a 200 rpm.
3. No dia da tela, prepare uma subcultura da pré-cultura durante a noite, diluindo-a primeiro com meio LB fresco para um OD₆₀₀ de 1,0 e, em seguida, diluindo ainda mais com 5% LB para um OD₆₀₀ de 0,04 (proporção de 1:25).
   Nota: O volume total do meio inoculado depende do número de placas a ensaiar. 5% LB é feito diluindo 100% LB com solução salina tamponada com fosfato (PBS) até a concentração necessária. É importante ressaltar que o meio (5% LB) permite a ativação constitutiva de pCdrA::gfp^C em P. aeruginosa.
4. Adicione uma barra de agitador magnético estéril no recipiente e agite a cultura em velocidade mínima em um agitador magnético por 30 min em temperatura ambiente, permitindo que as bactérias se aclimatem ao meio antes de serem dispensadas em placas de 384 poços.

3. Inoculação e incubação das placas de 384 poços contendo pequenas moléculas

Nota: A esterilidade e as boas técnicas assépticas são fundamentais para as etapas a seguir.

1. Para preparar o controlo positivo (inibição a 100%), adicionar 20 μl de sulfato de tobramicina (25 mg/ml) a 10 ml (adequado para um máximo de 12 placas) da subcultura preparada no passo 2.3 e misturar suavemente. Pipetar 40 μl da cultura de controlo positivo para os alvéolos A23-P23 (figura 1).
2. Para preparar o controlo negativo (inibição de 0%), adicionar 30 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) a 10 ml (adequado para um máximo de 12 placas) da subcultura preparada no passo 2.3 e misturar suavemente. Pipetar 40 μl da cultura de controlo negativo para os alvéolos A24-P24 (figura 1).
3. Para cada uma das placas marcadas com as pequenas moléculas, inocular um volume de 40 μl das culturas diluídas durante a noite (descritas no passo 2.3) nos alvéolos A1-P22 (figura 1).
   Nota: Isso pode ser alcançado usando um robô manipulador de líquidos. Devido às propriedades heterogêneas das culturas bacterianas, é importante manter uma agitação contínua e moderada para manter as bactérias consistentemente distribuídas no meio durante a dispensação. Para fazer isso, continue mexendo a cultura aclimatada da etapa 2.4 magneticamente durante a dispensação.
4. Sele as placas com uma vedação de tampa permeável ao ar e incube por 6 horas a 37 °C.
   Nota: A vedação permeável ao ar é fundamental para manter as condições imutáveis em todos os 384 poços e para contornar o desenvolvimento potencial de gradientes de oxigênio na placa.

4. Medição do crescimento (OD600) e nível intracelular de c-di-GMP (GFP)

1. Aproximadamente 30 minutos antes da medição espectrofotométrica, pré-aqueça o leitor de placas a 37 °C para evitar condensação.
2. Remova cuidadosamente a vedação da tampa permeável ao ar antes de ler. Meça a densidade óptica em um comprimento de onda de 600 nm com uma configuração de 10 flashes por poço e um tempo de estabilização de 0,2 seg.
3. Antes de medir a fluorescência, faça um ajuste automático de ganho e foco com base no poço A24 (controle negativo) e defina o valor alvo de ganho em 75% (Figura 1).
   1. No software de controle do leitor de placas, clique em iniciar medição e clique na guia ''Ajuste de foco e ganho/IDs de placa''.
   2. Selecione ''Ajuste de Foco'' e ''Canal A'' à direita na janela.
   3. Selecione ''Ajuste de ganho'' e ''Poço selecionado'', e digite ''75'' como o ''Valor alvo''. Por fim, escolha bem A24 no layout da placa antes de clicar em ''Iniciar ajuste''. Uma vez realizado o ajuste, clique em ''Iniciar medição''.
   4. Meça a fluorescência do repórter GFP a um máximo de excitação/emissão de 485/520 nm com uma configuração de 10 flashes por poço e um tempo de estabilização de 0,2 seg.
4. Colete dados de todas as placas examinadas.
   Observação: As leituras de dados são salvas automaticamente como padrão pelo software de controle do leitor de placas.
   1. Visualize as leituras clicando no ícone "Marte" no software de controle para abrir o pacote de análise estatística.
   2. Recupere os dados "clicando duas vezes" no número da placa de interesse para acessar os dados para análise.

Results

Figura 1. Um mapa de placa de 384 poços usado para o ensaio de triagem de moléculas pequenas. Os compostos da biblioteca (azul claro) são aliquotados nos poços A1-P22. O "controle positivo" (vermelho), consistindo em uma concentração final de...

Materials