Uma técnica para preparar uma cultura bacteriana monoclonal

Resumo

Fonte: Lin, P., et al. Sintetizando microcápsulas de tungstato de sódio e molibdato de sódio por meio de excreção de minerais bacterianos. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra a preparação de uma cultura bacteriana monoclonal para produção mineral por meio de diluição seriada e isolamento de colônias em uma placa de ágar. Ao agitar a placa com contas de vidro, as células individuais são separadas espacialmente para formar colônias geneticamente uniformes, que são então transferidas para meios líquidos para crescimento. A cultura com maior turbidez é selecionada, indicando a população monoclonal mais densa e o maior potencial de produção mineral.

Protocolo

1. Preparação de contas de vidro

1. Coloque 100 contas de vidro de 3 mm de diâmetro em um frasco de laboratório de 100 mL e tampe-o bem.
2. Autoclave o conteúdo a 120 °C por 10 min.
3. Deixe a garrafa esfriar até a temperatura ambiente e coloque-a no gabinete de biossegurança.

2. Preparação do Caldo de Lisogenia (LB)

1. Dissolva 8 g de pó de caldo LB-Lennox em um frasco de laboratório de 500 mL com 400 mL de água.
2. Mexa o conteúdo com uma barra de agitação magnética de politetrafluoretileno (PTFE) por 20 min e, em seguida, tampe bem.
3. Autoclave o conteúdo a 120 °C por 10 min.
4. Deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente e coloque-a no gabinete de biossegurança.
5. Usando uma pipeta, alíquota do caldo em oito tubos de centrífuga de 15 mL (12,5 mL cada) na cabine de biossegurança.
6. Aliquotar o caldo restante em três frascos de laboratório de 100 mL na cabine de biossegurança (100 mL cada). Tampe bem as três garrafas. Mantenha-os no gabinete de biossegurança.

3. Cultura de algas Shewanella

1. Use a cepa criopreservada ultracongelada.
2. No gabinete de biossegurança, retire 1 mL do material congelado do tubo congelado com uma espátula de aço inoxidável e coloque-o em um tubo de centrífuga preparado na etapa 3.5.
3. Incubar as culturas durante 24 h numa incubadora a 37 °C.

4. Preparação de placas de Petri LB-Lennox (caldo com ágar)

1. Dissolva dois comprimidos de LB-Lennox (caldo com ágar) em um frasco de laboratório de 100 mL com 100 mL de água.
2. Mexa o conteúdo com uma barra de agitação magnética de PTFE por 20 min e tampe bem.
3. Autoclave o conteúdo a 120 °C por 10 min.
4. No gabinete de biossegurança, alíquota manualmente 100 mL de solução em 4 placas de Petri, garantindo que cada uma receba ~ 25 mL. Deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente.

5. Preparação de bactérias monoclonais

1. No gabinete de biossegurança, rotule os três frascos preparados nas etapas 2.6, #1, #2 e #3, respectivamente.
2. Pipete 0,1 mL da suspensão bacteriana resultante na etapa 3.3 para o frasco #1. Tampe o frasco e balance-o manualmente por 1 min para obter uma solução homogênea.
3. Pipete 0,1 mL do líquido bacteriano resultante na etapa 5.2 para o frasco #2. Tampe o frasco e balance-o manualmente por 1 min para obter uma solução homogênea.
4. Pipete 0,1 mL do líquido bacteriano resultante na etapa 5.3 para o frasco #3. Tampe o frasco e agite-o com a mão por 1 min para obter uma solução homogênea.
5. Pipete o líquido do frasco #3 nas 4 placas de Petri preparadas na etapa 4.4, usando um volume de 0,02 mL cada.
6. Coloque as contas de vidro preparadas na etapa 1.3 nas 4 placas de Petri usadas, 4 contas em cada prato.
7. Feche as tampas das placas de Petri e agite-as com a mão por 1 min.
8. Vire as placas de Petri de cabeça para baixo e incube em uma incubadora a 37 °C por 24 h.

6. Multiplicação de bactérias monoclonais

1. Pegue 7 tubos preparados na etapa 2.5.
2. Retire as bactérias monoclonais resultantes das 4 placas de Petri preparadas na etapa 5.8 com uma espátula de aço inoxidável e coloque-as em 7 tubos separadamente.
3. Deixe os 7 tubos em uma incubadora a 37 °C por 24 h.
4. Escolha aquele com a maior dispersão de luz usando o método colorimétrico visual.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
LB (caldo Lennox) com comprimidos de ágar	Sigma-Aldrich	L7075	1 comprimido para 50 mL de caldo com ágar-ágar
LB (caldo Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) em pó 1 kg
Dextrose anidra	Reagente de Nihon Shiyaku	PL 78695	glicose
Tubo centrífugo de 50 mL	Falcão	14-432-22
Tubo centrífugo de 15 mL	Falcão	14-959-53UMA
Frasco de laboratório 100 mL	Duran	21 801 24 5
Frasco de laboratório 500 mL	Duran	21 801 44 5
Espátula de aço inoxidável	Chemglass	CG-1981-10
Barras de agitação descartáveis de PTFE	Pescador	S68066
Placas de Petri de plástico	Pescador	S33580A
Incubadora	Feito pelo cliente	feito sob medida	aquecer a 40 °C ou arrefecer a 18 °C com tempo de controlo
Gabinete de biossegurança	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	Todos os processos relacionados a bactérias são feitos aqui
Autoclave	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Cidade de Taipei, Taiwan, ROC	TM-329	aqueça a 120 °C por 10 min