Síntese de microcápsulas de óxido metálico usando bactérias redutoras de metais

Resumo

Fonte: Lin, P., et al. Sintetizando microcápsulas de tungstato de sódio e molibdato de sódio por meio de excreção de minerais bacterianos. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra o procedimento para sintetizar microcápsulas rígidas de óxido metálico por meio da cultura de bactérias redutoras de metal com íons metálicos, seguido de purificação sequencial por sonicação, centrifugação e lavagem com etanol.

Protocolo

CUIDADO: Use luvas de látex, óculos de proteção e um jaleco de laboratório para realizar o experimento. Sempre que usar o gabinete de biossegurança, ligue o ventilador do gabinete e mantenha a porta do gabinete semifechada.

1. Preparação de contas de vidro

1. Coloque 100 contas de vidro de 3 mm de diâmetro em um frasco de laboratório de 100 mL e tampe-o bem.
2. Autoclave o conteúdo a 120 °C por 10 min.
3. Deixe a garrafa esfriar até a temperatura ambiente e coloque-a no gabinete de biossegurança.

2. Preparação do Caldo de Lisogenia (LB)

1. Dissolva 8 g de pó de caldo LB-Lennox em um frasco de laboratório de 500 mL com 400 mL de água.
2. Mexa o conteúdo com uma barra de agitação magnética de PTFE (politetrafluoretileno) por 20 min e, em seguida, tampe bem.
3. Autoclave o conteúdo a 120 °C por 10 min.
4. Deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente e coloque-a no gabinete de biossegurança.
5. Usando uma pipeta, alíquota do caldo em oito tubos de centrífuga de 15 mL (12,5 mL cada) na cabine de biossegurança.
6. Alíquota do caldo restante em três frascos de laboratório de 100 mL (100 mL cada) na cabine de biossegurança. Tampe bem os três frascos e guarde-os no armário de biossegurança.

3. Cultura de algas Shewanella

1. Use a cepa criopreservada ultracongelada.
2. No gabinete de biossegurança, retire 1 mL do material congelado do tubo congelado com uma espátula de aço inoxidável e coloque-o em um tubo de centrífuga preparado na etapa 3.5.
3. Incubar as culturas durante 24 h numa incubadora a 37 °C.

4. Preparação de placas de Petri LB-Lennox (caldo com ágar)

1. Dissolva dois comprimidos de LB-Lennox (caldo com ágar) em um frasco de laboratório de 100 mL com 100 mL de água.
2. Mexa o conteúdo com uma barra de agitação magnética de PTFE por 20 min e tampe bem.
3. Autoclave o conteúdo a 120 °C por 10 min.
4. Na cabine de biossegurança, alíquota manualmente 100 mL de solução em 4 placas de Petri, garantindo que cada uma receba ~ 25 mL. Deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente.

5. Preparação de bactérias monoclonais

1. No gabinete de biossegurança, rotule os três frascos preparados nas etapas 2.6, #1, #2 e #3, respectivamente.
2. Pipete 0,1 mL da suspensão bacteriana resultante na etapa 3.3 para o frasco #1. Tampe o frasco e balance-o com a mão por 1 min para obter uma solução homogênea.
3. Pipete 0,1 mL do líquido bacteriano resultante na etapa 5.2 para o frasco #2. Tampe o frasco e balance-o com a mão por 1 min para obter uma solução homogênea.
4. Pipete 0,1 mL do líquido bacteriano resultante na etapa 5.3 para o frasco #3. Tampe o frasco e agite-o com a mão por 1 min para obter uma solução homogênea.
5. Pipete o líquido do frasco #3 nas 4 placas de Petri preparadas na etapa 4.4, usando um volume de 0,02 mL cada.
6. Coloque as contas de vidro preparadas na etapa 1.3 nas 4 placas de Petri usadas, 4 contas em cada prato.
7. Feche as tampas das placas de Petri e agite-as com a mão por 1 min.
8. Vire as placas de Petri de cabeça para baixo e incube em uma incubadora a 37 °C por 24 h.

6. Multiplicação de bactérias monoclonais

1. Pegue 7 tubos preparados na etapa 2.5.
2. Retire as bactérias monoclonais resultantes das 4 placas de Petri preparadas na etapa 5.8 com uma espátula de aço inoxidável e coloque-as em 7 tubos separadamente.
3. Deixe os 7 tubos em uma incubadora a 37 °C por 24 h.
4. Escolha aquele com a maior dispersão de luz usando o método colorimétrico visual.

7. Preparação do Caldo LB-Lennox com Glicose e Sal

1. Coloque 10 g de caldo LB-Lennox, 10 g de NaCl e 10 g de glicose em um frasco de laboratório de 500 mL. Adicione água até que o volume atinja 450 mL.
2. Mexa o conteúdo com uma barra de agitação magnética de PTFE por 20 min.
3. Autoclave o conteúdo a 120 °C por 10 min.

8. Preparação de Tungstato de Sódio

1. Coloque 16,5 g de tungstato de sódio Na₂WO 4,2H₂O em um frasco de laboratório de 100 mL com uma espátula de aço inoxidável. Adicione água até que o volume atinja 50 mL.
2. Mexa o conteúdo com uma barra de agitação magnética de PTFE por 20 min.
3. Autoclave o conteúdo a 120 °C por 10 min.
4. No gabinete de biossegurança, obtenha o filtrado por meio de um filtro de fibra de vidro a vácuo com poros de 1 μm.

9. Preparação de LB com Glicose, Sal e Tungstato de Sódio

1. Na cabine de biossegurança, despeje o filtrado obtido na etapa 8.4 manualmente na solução com glicose e sal preparados na etapa 7.3.
2. Na cabine de biossegurança, alíquota com uma pipeta a solução resultante de 500 mL na etapa 9.1 em tubos de centrífuga de 10 x 50 mL.

10. Cultura de bactérias

1. Na cabine de biossegurança, buscar o líquido preparado na etapa 6.4 e alíquota com uma pipeta nos 10 tubos de ensaio preparados na etapa 9.2, com cada tubo recebendo 0,05 mL.
2. Incubar os 10 tubos numa incubadora a 37 °C durante 120 h.

11. Colheita de minerais BME

1. Ultrassonice cada um dos 10 tubos na etapa 9.2 a 20 KHz com 150 W por 1 h.
2. Centrifugar os tubos a 2,025 x g durante 1 h.
3. Remova o líquido transparente dos tubos com uma pipeta, adicione água e repita as etapas 11.1 e 11.2 mais uma vez.
4. Remova o líquido transparente nos tubos com uma pipeta, adicione álcool e, em seguida, ultrassone-os a 20 KHz com 150 W por 1 h.
5. Centrifugar os tubos a 2,025 x g durante 1 h.
6. Repita as etapas 11.4 e 11.5 mais uma vez
7. Colha os minerais BME removendo o líquido claro nos tubos com uma pipeta; Em seguida, tampe imediatamente os tubos sem executar nenhum processo de secagem.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
LB (Lennox) caldo com comprimidos de ágar	Sigma-Aldrich	L7075	1 comprimido para 50 mL de caldo com ágar-ágar
Caldo LB (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) em pó 1 kg
Dextrose anidra	Reagente de Nihon Shiyaku	PL 78695	glicose
Tungstato de sódio	Reagente de Nihon Shiyaku	PL 76050	Na2WO4 · 2H2O
Cloreto de sódio	Reagente de Nihon Shiyaku	PL 68131	NaCl
Etanol 99,5%	Acros orgânicos	AC615090040	CH3CH2OH
Água	Feito em nossa universidade		Água desionizada
Autoclave	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Cidade de Taipei, Taiwan, ROC	TM-329	aqueça a 120 °C por 10 min
Centrifuga	Sistema de laboratório de sistema de dígitos, nova cidade de Taipei, Taiwan, ROC	DSC302SD	centrífuga em 2025 x g
-80 °C Geladeira	Panasonic	MDF-U3386S	Use para congelar a cepa criopreservada
Disruptor ultrassônico da pilha do processador de Sonicator do homogeneizador ultrassônico	Lenox	UPS-150	frequência 20 KHz potência 150 W
Incubadora	Feito pelo cliente	feito sob medida	aquecer a 40 °C ou arrefecer a 18 °C com tempo de controlo
Banhos de agitação recíprocos	Kingtech Scientific Co., Ltd	WBS-L
Placa quente de agitação digital	Corning	#6797-620D	uso com barra de agitação magnética de PTFE
Gabinete de biossegurança	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	Todos os processos relacionados a bactérias são feitos aqui
Tubo centrífugo de 50 mL	Falcão	14-432-22
Tubo centrífugo de 15 mL	Falcão	14-959-53UMA
Frasco de laboratório 100 mL	Duran	21 801 24 5
Frasco de laboratório 500 mL	Duran	21 801 44 5
Espátula de aço inoxidável	Chemglass	CG-1981-10
Barras de agitação descartáveis de PTFE	Pescador	S68066
Placas de Petri de plástico	Pescador	S33580A
Algas Shewanella	Cortesia do autor # 3	Cortesia do autor # 3