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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Desenho experimental
- Iniciar o tratamento dos animais por gavagem oral, após 2 dias de aclimatação. Use uma seringa com a agulha de gavagem oral. Tratar 16 ratos com suspensão de Bacillus subtilis BSB3 (1 ml por rato) duas vezes por dia durante dois dias (grupo B. subtilis). Trate 16 ratos com solução salina tamponada com fosfato, PBS (1 ml por rato), duas vezes ao dia durante dois dias (grupo PBS) (Figura 1).
- Após o tratamento, subdividir cada grupo (8 ratos por grupo): Grupo 1-controle (PBS/sem estresse), Grupo 2-B. subtilis (B. subtilis /sem estresse), Grupo 3-estresse (PBS/estresse térmico) e Grupo 4- B. subtilis + estresse (B. subtilis/estresse térmico).
- Meça a temperatura retal de cada rato usando um termômetro digital eletrônico. Mantenha os ratos dos grupos 1 e 2 em temperatura ambiente por 25 min. Colocar os animais dos grupos 3 e 4 numa câmara climática a 45 °C e 55% de humidade relativa durante 25 min.
- Em seguida, medir a temperatura retal de cada rato em todos os grupos usando um termômetro digital eletrônico. Coloque todos os animais em temperatura ambiente por 4 horas.
- Anestesiar ratos com isoflurano (2 - 4%) em um frasco de anestesia lacrado e observar até que os ratos estejam profundamente anestesiados (ausência de resposta ao beliscão do dedo do pé). Eutanásia de ratos por decapitação rápida com uma guilhotina.
- Coletar sangue do tronco de cada rato (15 - 16 ml) com as pipetas apirogênicos em tubos apirogênicos para obter soro e colher imediatamente amostras de sangue (7 μl de cada rato) com uma pipeta para exame microscópico.
- Coloque os tubos com o sangue na geladeira por pelo menos 30 minutos para permitir a coagulação. Centrifugue os tubos a 20 °C, 7.000 x g por 10 min e remova rapidamente o soro com uma pipeta. Alíquota do soro obtido de cada rato em volumes de 50 μl e conservá-lo a -20 °C até ao ensaio.
2. Procedimento cirúrgico
- Corte/apare toda a pele do abdômen e tórax da parte inferior da carcaça com uma tesoura elétrica. Coloque a carcaça em um armário estéril e trate a superfície raspada da carcaça com álcool 70%.
- Use um bisturi estéril para criar uma incisão na linha média do abdômen. Remova o fígado, os gânglios linfáticos mesentéricos, o baço e o intestino delgado de cada rato usando uma pinça estéril.
3. Análise de Translocação Bacteriana
- Coloque cada amostra de fígado, gânglios linfáticos mesentéricos e baço em tubos estéreis pré-pesados e pese. Calcule o peso da amostra como a diferença entre o peso de um tubo com uma amostra e o peso de um tubo vazio.
- Adicione PBS estéril ao tubo para obter uma diluição de 1:10 (peso por volume, p / v) da amostra e homogeneize cada amostra com um homogeneizador de tecido de vidro estéril para obter uma suspensão homogênea.
- Fazer diluições seriadas (10-1 a 10-4) de cada amostra em PBS estéril. Colocar 0,1 ml de todas as diluições de cada tecido na superfície do ágar sangue MacConkey e 5% e ágar sangue Brucella com placas de hemina (0,005 g/L) e vitamina K1 (0,01 g/L).
- Incubar placas de ágar sangue de MacConkey e 5% aeróbicas e placas de ágar sangue Brucella em condições anaeróbicas a 37 oC.
- Conte colônias de bactérias aeróbicas após 24 horas e colônias de bactérias anaeróbicas após 48 horas de incubação usando um contador de colônias. Expresse os resultados como o número de unidades formadoras de colônias (UFC) em um grama de tecido.
