Produção e deposição à base de aerossóis de esporos de Bacillus subtilis

Resumo

Fonte: Fuchs, F. M., et al. Investigando os efeitos prejudiciais da esterilização por plasma de baixa pressão na sobrevivência dos esporos de Bacillus subtilis usando microscopia de células vivas. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a produção, purificação e deposição baseada em aerossol de esporos de Bacillus subtilis para criar uma monocamada uniforme, permitindo aplicações a jusante, como análise baseada em microscopia da germinação de esporos, viabilidade ou resposta ao estresse.

Protocolo

1. Produção e purificação de esporos de Bacillus subtilis

1. Para a produção de esporos, transfira uma cultura noturna de 5 mL da respectiva cepa de B. subtilis , suplementada com antibióticos apropriados, para 200 mL de meio de esporulação Schaeffer líquido de dupla força (por litro 16 g de caldo de nutrientes, KCl (cloreto de potássio) 2 g, 0,5 g MgSO₄*7 H₂O (sulfato de magnésio heptahidratado), 2 mL 1 M Ca(NO₃)₂ (nitrato de cálcio), 2 mL 0,1 M MnCl₂ *• 4 H₂O (cloreto de manganês tetrahidratado), 2 mL 1 mM FeSO₄ (sulfato ferroso), 2 mL 50% (p/v) de glicose18) e cultivá-lo com aeração vigorosa a 37 °C por 72 h ou até > 95% da cultura esporulada. Os esporos das seguintes cepas são usados: B. subtilis PY79 (tipo selvagem) B. subtilis PY79ΔrecA::neo (deficiente em proteína de reparo de DNA RecA) B. subtilis PY79 recA-yfp::cat (RecA fundido com proteína fluorescente amarela [YFP]).
2. Colha esporos por centrifugação por 15 min a 3.000 x g em tubos de 50 mL e purifique as amostras por etapas de lavagem repetidas (até 15 vezes) usando H₂O destilado estéril e verifique a pureza e o status de germinação por microscopia de contraste de fase. Certifique-se de que as suspensões de esporos consistem em esporos de fase brilhante (> 99%) e estão livres de células vegetativas (bastonetes), esporos germinados (aparência preta/cinza) e detritos celulares; caso contrário, outros experimentos de microscopia podem ser perturbados. Lave a amostra até atingir a pureza desejada.
3. Determine o título de esporos retirando 50 μL de diluições seriais de 10 vezes em ágar LB (luria-bertani) (ou seja: Use 30 μL de amostra + 270 μL de água estéril para uma diluição de 1:10. Pegue 30 μL da diluição específica para 270 μL H₂O para uma diluição de 1:100 e assim por diante) para calcular as UFC (unidades formadoras de colônias) e incubar as placas a 37 ° C durante a noite. Após a determinação da UFC, ajustar a amostra para 10⁹ esporos por ml, concentrando ou diluindo com água estéril.

2. Preparação de amostras de esporos de Bacillus subtilis depositados em aerossol

NOTA: O acúmulo e a sobreposição de esporos podem levar a efeitos de sombreamento durante o tratamento, resultando em cinética de inativação falsificada. Para minimizar esse problema, prepare amostras de esporos por uma técnica de deposição de aerossol. Resumidamente, controle o bico de duas substâncias de alta precisão com um temporizador elétrico que regula a vazão do líquido em conjunto com o fluxo de gás de arraste pressurizado (aqui N₂). Dispersar a amostra líquida injectada através da saída do bocal utilizando o fluxo de gás azoto.

1. Coloque um transportador de amostra na forma de lâminas microscópicas esterilizadas (para cinética de sobrevivência) ou lamínulas redondas de 25 mm (para rastreamento fluorescente de processos de reparo de DNA / cLSM; microscopia confocal de varredura a laser) dentro da unidade de pulverização de aerossol operada eletricamente em alinhamento com o bico. A concentração de esporos usada precisa corresponder a cem vezes a concentração final desejada.
2. Transfira 1 mL da cultura de esporos para a entrada do fluido do bico e inicie o processo de pulverização de 0,1 s a uma pressão de 1,3 bar. A suspensão de esporos pulverizada (1 x 10⁷) forma uma película fina na lâmina microscópica que seca rapidamente em segundos para formar uma monocamada de esporos uniformemente distribuída. Armazenar os suportes de amostras tratados num recipiente estéril à temperatura ambiente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bico de duas substâncias (modelo 970-8)	Schlick	14,404	230 V, 50 Hz, P 4.484/8, diâmetro do furo de 0,8 mm
Luria Bertani Médio	Sigma Aldrich	70122-100G
Conectores de tubo	Festo	n/a	G 1/8
Lâminas de vidro	VWR	48300-026
Câmara celular de attofluor	Menzel, Fisher Ref.	3406816	d=25 mm, redondo
Sulfato de magnésio heptahidratado	Sigma Aldrich	13152
Nitrato de cálcio	Sigma Aldrich	202967
Cloreto de manganês tetra-hidratado	Sigma Aldrich	244589
Sulfato ferroso	Aplicação	13446-34-9
Glicose	Merck	215422
Cloreto de potássio	Sigma Aldrich	Rolamento P9541-500G
Caldo Nutriente (NB)	Merck	105443
Luria-Bertani (LB)	Merck	110283
Placa de 96 poços	ThermoFisher	243656