Análise de Viabilidade de Microcystis aeruginosa Utilizando Citometria de Fluxo

Resumo

Fonte: Chapman, I. J., et al., Otimização de Sonda Molecular para Determinar a Mortalidade Celular em um Organismo Fotossintético (Microcystis aeruginosa) Usando Citometria de Fluxo. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o método para distinguir células vivas e mortas de Microcystis aeruginosa , combinando a marcação de sonda fluorescente com análise de citometria de fluxo de autofluorescência de ficocianina e sinal de sonda.

Protocolo

1. Otimização da captação de células de sonda molecular

1. Colha metade da cultura de M. aeruginosa de uma fase exponencial e use-a como um controle 'vivo'.
   NOTA: Amostras diluídas de uma cultura de alta densidade direto para uma fase exponencial podem afetar os resultados de otimização por meio da renovação de células mortas em comparação com culturas inoculadas de uma fase inicial de atraso/indução.
2. Prepare a outra metade como um controle "morto" usando métodos como etanol a 70%, amostras de aquecimento a 60 ^oC por 1 hora, paraformaldeído ou formaldeído a 4% por 30 min. Verifique as variações no microambiente das amostras (por exemplo, pH).
   NOTA: O controle positivo, morto pelo calor e 'morto' em M. aeruginosa se distingue de uma amostra 'viva' por sua diminuição nos sinais de ficocianina. Induzir mortalidade por outros métodos pode não causar a mesma produção e varia de espécie para espécie.
3. Configure amostras mistas usando diferentes proporções de amostras "vivas" e "mortas" (por exemplo, 0%, 25%, 50%, 100%).
4. Desagregar a formação de colônias por vórtice ou sonicação e verificar o pH.
5. Selecione um laser de 488 nm ao lado de detectores que possam registrar fluorescência das sondas de ácido nucleico verde (canal de fluorescência 1 ou FL1, 530 ± 15 nm) e laranja (canal de fluorescência 2 ou FL2, 585 ± 20 nm) e o laser de 640 nm para registrar sinais de ficocianina através de seu respectivo detector.
   NOTA: Quando ligada ao DNA, a sonda de ácido nucleico verde tem um comprimento de onda de excitação de fluorescência aproximado de 504 nm e máximos de emissão de 523 nm, enquanto a sonda de ácido nucleico laranja tem um comprimento de onda de excitação de 547 nm e máximos de emissão de 570 nm. Um laser de estado sólido de íons de argônio de 488 nm pode ser empregado para excitar ambas as sondas moleculares, no entanto, um laser verde (até 547 nm) produzirá uma fluorescência laranja mais alta.
6. Como ponto de partida, introduza a sonda molecular na concentração recomendada pelo fabricante para a cultura de 50% "viva" e 50% "morta" e incube no escuro.
7. Selecione uma nova célula de dados, coloque a amostra sob a porta de introdução da amostra (SIP) com limites e gatilhos que reduzirão o ruído de fundo (FSC-H ou altura de dispersão direta, 80.000).
8. Crie um gráfico de densidade com os parâmetros FSC-H e SSC-H (altura de dispersão lateral) e três histogramas. Um histograma usando o respectivo canal do detector óptico da sonda molecular (FL1 ou 2), um para detectar emissões de ficocianina (altura do canal de fluorescência 4 ou FL4-H) e o outro, FSC-H, todos em escala logarítmica.
9. Incube as amostras de M. aeruginosa com as sondas de ácido nucleico no escuro por até 60 min, registrando em células de dados separadas em vários pontos de tempo (1, 5, 10, 15, 30 e 60 min).
   NOTA: Ao ajustar parâmetros como pH, verifique com os fabricantes se há possíveis reações de certos produtos químicos (para as sondas de ácido nucleico testadas, um tampão não pode conter fosfatos ou altos níveis de cátions monovalentes ou divalentes, pois a ligação com o DNA será reduzida).
10. Aplique uma porta de software para incluir apenas o histograma FSC-H (320.000 - 1.500.000) para o tamanho da célula do organismo alvo no respectivo histograma do canal da sonda de fluorescência.
    NOTA: As concentrações utilizadas neste protocolo foram 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 e 100 μM, que podem ser alteradas aumentando ou diminuindo o volume da amostra de M. aeruginosa ou a solução estoque inicial de sondas nucléicas.
11. No canal da sonda de fluorescência, aplique outra porta de software inclusiva ao pico mais alto do histograma (FL1-H verde, 240.000 - 1.650.000, FL2-H laranja, 30.000 - 165.000) e, posteriormente, coloque essa fluorescência de sonda positiva no gráfico de densidade.
12. Execute as etapas 3.1 a 3.11 com 100% "vivo", 100% "morto" e todas as amostras de cultura mista, ajustando as concentrações da sonda molecular (por exemplo, x 0,1 a x 10) e/ou temperatura e níveis de pH, se necessário.
13. Compare o número de sinais positivos de fluorescência da sonda molecular com a densidade celular original das células "mortas" (retirada da metade do FSC-H total ou de uma cultura 100% "morta") para encontrar a porcentagem total de células coradas com as sondas de ácido nucleico.
14. Faça isso para cada período de tempo dentro de cada concentração para encontrar o protocolo ideal para a maior porcentagem de captação da sonda nucleica celular sem produzir coloração inespecífica (use as médias em uma análise de variância unidirecional, ANOVA ou análise de variância unidirecional de Kruskal-Wallis se os dados não forem paramétricos).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cianobactérias Mídia	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Solução concentrada de água doce (diluição x50)
Fluido de descontaminação	BD Biociências	653155	Execute por 2 min quando as saídas forem superiores a 12 eventos por segundo em rápido ou com uma taxa de fluxo de 66 μl/min. Seguido por 2 min de bainha H2O.
Citômetro de fluxo	BD Biociências	a pedido	BD Accuri C6
SYTOX Verde	Tecnologias da Vida	S7020	Coloração de ácido nucleico – solução 5 mM em DMSO
SYTOX Laranja	Tecnologias da Vida	S11368	Coloração de ácido nucleico – solução 5 mM em DMSO