Avaliação da atividade antimicrobiana de variantes de nisina usando um ensaio de difusão de ágar bem

Resumo

Fonte: Nickling, J. H., et.al. Peptídeos antimicrobianos produzidos por incorporação de aminoácidos não canônicos por pressão. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra um ensaio de difusão em ágar usado para avaliar a atividade antimicrobiana de variantes de nisina. Ele mostra como o Lactococcus lactis expressando a peptidase ligada à membrana NisP ativa os precursores da nisina produzidos em E. coli, resultando em halos de inibição do crescimento. O tamanho desses halos reflete a bioatividade de cada variante de nisina.

Protocolo

1. Teste de atividade antimicrobiana

1. Preparação de placas de ágar-GM17 em condições estéreis
   1. Preparar uma cultura durante a noite da estirpe indicadora L. lactis NZ9000 portadora de plasmídeo pNG nisPT a 30 °C em caldo M17 com 1% (p/v) de glicose (=GM17) e 5 μg/ml de cloranfenicol.
   2. Meça OD₆₀₀, inocule o meio fresco até OD₆₀₀ = 0,1 e incube até OD₆₀₀ = 0,4-0,6. Em seguida, coloque o balão no gelo.
      NOTA: Cada medição OD₆₀₀ consumirá volume de cultura. Lembre-se de que, para cada placa de ágar de ensaio, será necessária 1 mL de cultura bacteriana. Se necessário, aumente o volume de cultura líquida de acordo.
   3. Para 1,5% de ágar, pesar 4,5 g de ágar em um frasco de vidro. Adicione 300 mL ddH₂O, misture e autoclave.
   4. Prepare 2x caldo M17 (concentrado duas vezes) em 300 mL ddH₂O e autoclave.
   5. Misture 25 mL de caldo 2x M17 contendo 10 μg/mL de cloranfenicol e 2% de glicose com 1 mL de L . lactis em pré-cultura (4% v/v).
   6. Adicione 25 mL de ágar derretido a 1,5% (recém-autoclavado ou aquecido no micro-ondas).
      NOTA: Antes disso, deixe o frasco esfriar ao toque (cerca de 50 °C). Isso é necessário , pois L. lactis é um organismo mesófilo sensível a altas temperaturas.
   7. Despeje a solução em uma placa de Petri grande. Placas secas por 10-15 min.
   8. Esterilize as extremidades de uma pipeta Pasteur de vidro com chama. Espere esfriar e use a extremidade larga para criar buracos no ágar GM17 solidificado.
2. Preparação da amostra
   1. Pegue 1 mL das culturas de expressão de E. coli em um tubo rotulado de 1,5 mL e centrifugue por 3 min a 7.000 x g. Aspirar o meio restante e ressuspender o sedimento celular em 500 μL de Na-P (tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4 feito de di-hidrogenofosfato de sódio 0,5 M e hidrogenofosfato dissódico 0,5 M).
   2. Sonicar as amostras no gelo. Mergulhe a ponta da sonda sonicadora na suspensão celular. Ajustar o sonicador a uma amplitude de 30 % com um pulso de 1 s ligado e 5 s desligado durante 3 min.
   3. Centrifugue o lisado celular por 10 min a 13.000 x g para pellet de detritos celulares. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de reacção no gelo.
   4. Diluir e normalizar os sobrenadantes do extrato celular para 1 mL OD₆₀₀ = 0,6, em relação à densidade celular colhida, com Na-P.
3. Teste de atividade
   1. Adicione 40 μL de cada amostra normalizada em um orifício da placa de ágar indicador (Figura 1). Use cloranfenicol a 400 μg / mL como composto de controle antibacteriano. Use o tampão de eluição como um controle negativo. Aguarde até que todas as amostras sejam difundidas no ágar. Incubar a placa durante a noite a 30 °C.
   2. Tire fotos das placas de ágar usando um scanner de mesa ou câmera digital. Os tamanhos dos halos de inibição de crescimento podem ser medidos manualmente ou usando ImageJ.

Resultados

Figura 1. Ensaio de atividade antimicrobiana de lisados celulares contendo variantes de nisina produzidas via SPI com análogos de prolina. Comparação de variantes de nisina com amostras recombinantes do ...

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