Avaliação da atividade antimicrobiana de variantes de nisina usando um ensaio de difusão de ágar bem

Resumo

Fonte: Nickling, J. H., et.al. Peptídeos antimicrobianos produzidos por incorporação de aminoácidos não canônicos por pressão. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra um ensaio de difusão em ágar usado para avaliar a atividade antimicrobiana de variantes de nisina. Ele mostra como o Lactococcus lactis expressando a peptidase ligada à membrana NisP ativa os precursores da nisina produzidos em E. coli, resultando em halos de inibição do crescimento. O tamanho desses halos reflete a bioatividade de cada variante de nisina.

Protocolo

1. Teste de atividade antimicrobiana

1. Preparação de placas de ágar-GM17 em condições estéreis
   1. Preparar uma cultura durante a noite da estirpe indicadora L. lactis NZ9000 portadora de plasmídeo pNG nisPT a 30 °C em caldo M17 com 1% (p/v) de glicose (=GM17) e 5 μg/ml de cloranfenicol.
   2. Meça OD₆₀₀, inocule o meio fresco até OD₆₀₀ = 0,1 e incube até OD₆₀₀ = 0,4-0,6. Em seguida, coloque o balão no gelo.
      NOTA: Cada medição OD₆₀₀ consumirá volume de cultura. Lembre-se de que, para cada placa de ágar de ensaio, será necessária 1....

Resultados

Figura 1. Ensaio de atividade antimicrobiana de lisados celulares contendo variantes de nisina produzidas via SPI com análogos de prolina. Comparação de variantes de nisina com amostras recombinantes do .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Di-hidrogenofosfato de sódio mono-hidratado	Carl Roth, Alemanha	K300.2
Hidrogenofosfato dissódico	Carl Roth, Alemanha	Pág. 030.2
D-glicose	Carl Roth, Alemanha	6780	Prepare uma solução a 20% (p / v) para adição em ágar fundido
Cloranfenicol	Carl Roth, Alemanha	3886.1	Concentração de trabalho de 5 μg/mL para L. lactis, preparar estoque de 37 mg/mL em etanol
Caldo M17	Sigmal-Aldrich, Alemanha	56156	Produto comercial
Ágar-ágar	Carl Roth, Alemanha	5210.5
Nisina de Lactococcus lactis	Sigma-Aldrich, Alemanha	N5764	Produto comercial, pode ser usado como referência para bioatividade
Tubos Eppendorf de 1,5 mL	Eppendorf, Alemanha	30120086
Placas de Petri (poliestireno, estéreis)	Carl Roth, Alemanha	TA19
Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT			Cepa indicadora bacteriana
Centrífuga de bancada para tubos Eppendorf de 1,5 mL	Eppendorf, Alemanha	5427 R
Sonicador de sonda	Bandelin, Alemanha	Sonopuls HD3200 com sonotrodo MS-72	Saída HF máxima de 200 W