Preparação de Meio de Escarro Artificial para Emular Escarro de Pulmão com Fibrose Cística Ex Vivo

Resumo

Fonte: Vieira, J., et al. Desenho e desenvolvimento de um modelo para estudar o efeito do oxigênio suplementar no microbioma das vias aéreas da fibrose cística. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra a preparação de um meio de escarro artificial que imita a viscosidade, a composição de nutrientes e o pH do escarro pulmonar com fibrose cística. O meio resultante fornece uma plataforma fisiologicamente relevante para estudos ex vivo.

Protocolo

1. Preparação de Meio de Escarro Artificial

NOTA: As quantidades aqui indicadas destinam-se à produção de 1 L de meio de expetoração artificial final e assumem os reagentes específicos indicados no Quadro de Materiais. Os números devem ser ajustados para outros volumes ou para a utilização de reagentes diferentes, a fim de garantir o mesmo produto final. Ver quadro 1 para as concentrações-alvo.

1. Mistura química de escarro artificial (ASCM)
   NOTA: O ASCM representa 25% do volume médio final. É estável na prateleira e pode ser preparado a granel ou com antecedência. Se estiver sendo preparado para uso posterior, autoclave a mistura química e armazene-a com segurança em temperatura ambiente.
   1. Misturar as soluções de reserva químicas constituintes.
      1. Prepare 1 M de caldo de NaCl: Adicione 58,44 g de NaCl por litro de água estéril.
      2. Prepare 1 M KCl caldo: Adicione 74,55 g de KCl por litro de água estéril.
      3. Prepare o estoque de 1 M MgSO₄ : Adicione 246,47 g de MgSO₄·7H₂O por litro de água estéril ou 120,37 g de MgSO₄ anidro por litro de água estéril.
      4. Prepare o estoque de glicose 1 M: Adicione 180,16 g de glicose por litro de água estéril.
   2. Esterilize em autoclave as soluções de estoque de produtos químicos, bem como um frasco vazio de 250 mL. Execute as etapas de autoclavagem com pelo menos valores padrão de 121 °C e 15 PSI por 30 min.
   3. Adicione 80,59 mL de água estéril ao frasco vazio de 250 mL.
   4. Adicione 152,30 mL de caldo de NaCl 1 M à mistura.
   5. Adicione 15,8 mL de caldo 1 M KCl à mistura.
   6. Adicione 610 μL de estoque de MgSO₄ 1 M à mistura.
   7. Adicione 700 μL de estoque de glicose 1 M à mistura.
2. Mistura de mucina de escarro artificial (ASMM)
   NOTA: A ASMM representa 50% do volume médio final. Certifique-se de que seja preparado no mesmo dia do lote médio final.
   1. Adicione 450 mL de água estéril a um frasco vazio de 1 L.
   2. Adicione 50 mL de solução salina tamponada com fosfato 10x (PBS) ao frasco.
   3. Adicione uma barra de agitação magnética descartável à garrafa.
   4. Autoclave o frasco contendo PBS e a barra de agitação.
   5. Meça 10 g de mucina em pó e adicione ao PBS.
   6. Agite vigorosamente o frasco para uma mistura preliminar.
   7. Coloque a garrafa em uma placa quente com um agitador magnético. Defina o fogo para médio-alto, visando 50 °C e velocidade de agitação para 1100 rpm. Aumente a velocidade gradualmente para que a barra não voe para fora do ímã.
      1. Deixe aquecer e mexa durante 15 min.
      2. Pegue a garrafa com luvas resistentes ao calor. Observe para verificar se o pó de mucina se deposita fora da solução.
      3. Se o pó de mucina não estiver totalmente dissolvido, retorne o frasco ao calor/agitador por intervalos de 5 minutos até que esteja completamente dissolvido.
   8. Deixe a mistura de mucina esfriar até a temperatura ambiente.
3. Mistura biológica de escarro artificial (ASBM)
   NOTA: ASBM é 25% do volume médio final. Prepare-o no mesmo dia do lote médio final e, ao contrário das outras misturas, não exponha seus componentes ao calor.
   1. Descongele o caldo de vitaminas 100x em uma geladeira a 4 °C ou no gelo. ​
      NOTA: Pré-divida o estoque de vitaminas em alíquotas de 10 mL para minimizar o número de ciclos de congelamento / descongelamento.
   2. Adicione 124,24 mL de água estéril ao frasco vazio autoclavado de 250 mL.
   3. Adicione 25,76 mL de estoque de aminoácidos essenciais 50x à mistura.
   4. Adicione 80,14 mL de estoque de aminoácidos não essenciais 100x à mistura.
   5. Adicione 10 mL de caldo de vitamina 100x (descongelado) à mistura.
   6. Adicione 1 mL de estoque de metais traços 1000x à mistura.
   7. Adicione 8,33 mL de emulsão de gema de ovo a 30% à mistura.
   8. Adicione 400 μL de estoque de ferritina 10 g/L à mistura.
   9. Misture bem a solução por agitação manual.
4. Meio de escarro artificial (ASM)
   1. Adicione 250 mL de ASCM ao frasco de 1 L contendo ASMM.
   2. Adicione 250 mL de ASBM ao frasco médio.
   3. Titular o meio com tampão MOPS básico (1 M) para atingir um pH de 6,3 em um papel de pH de faixa estreita. Antes da titulação, a mistura média será muito ácida.
   4. Refrigerar o meio de expetoração artificial resultante a 4 °C até que esteja pronto para filtração.
   5. Para iniciar o processo de filtração, transfira 200 mL de meio de escarro artificial não filtrado para um sistema de filtração a vácuo com um filtro de tamanho de poro de 0,22 μm.
   6. Conecte o sistema de filtragem à bomba de vácuo, ligue a bomba de vácuo, ajuste-a para 70 mbar e, em seguida, coloque a câmara em um agitador orbital agitando a 90 rpm em uma câmara fria a 4 ° C.
      1. Complete com mais 150 mL do meio, pois uma quantidade apreciável é filtrada. Demora 1-2 dias para filtrar completamente 1 L de meio.
      2. Repita com câmaras adicionais até que toda a mídia seja filtrada.
         NOTA: Tente não filtrar mais de 350 mL do meio através do mesmo filtro de 0,22 μm, pois a mucina obstruirá o filtro com o tempo.
   7. Refrigerar o meio de expetoração artificial filtrado a 4 °C até estar pronto a ser utilizado. Use o ASM dentro de um mês após a preparação para obter melhores resultados.

Tabela 1: Receita de meio de escarro artificial derivada de revisão da literatura. (Coluna 1) Reagentes e valores-chave na formulação de meio de escarro artificial. (Colunas 2-7) Comparação de receitas da literatura existente. (Colunas 8-9).

Coluna 1		Coluna 2	Coluna 3	Coluna 4	Coluna 5	Coluna 6	Coluna 7	Coluna 8	Coluna 9
Valor		Comstock	Kirchner	Sriramulu	Palmer	Flynn	Gallagher	Lai	Fonte
Mucina		2% p/v	0,5% p/v	0,5% p/v	-	1% p/v	2% p/v	1% p/v	Flynn
Cloreto de sódio		85,5 mM	85,5 mM	85,5 mM	66,6 mM	89,8 mM	85,5 mM	152,3 mM	Lapierre
Cloreto de potássio		29,5 mM	29,5 mM	29,5 mM	15,8 mM	-	2,95 mM	15,8 mM	Palmer
Sulfato de magnésio		-	-	-	0,6 mM	1 mM	1 mM	0,61 mM	Palmer
Sulfato de ferro		-	-	-	0,0036 mM	-	-	-	-
Cloreto de amônio		-	-	-	2,3 mM	60 mM	-	-	-
Fosfato monopotássico		-	-	-	2,5 mM	60 mM	-	-	-
Glicose		-	-	-	3,2 mM	13 mM	40 mM	0,7 mM	Sambeek
Lactato		-	-	-	9 mM	-	-	-	-
Aminoácidos Essenciais		14,45 vezes	0,25 g/L	0,25 g/L	Por ácido	0,5x	0,375x	1,29 vezes	Palmer
Aminoácidos não essenciais		28,9 vezes	0,25 g/L	0,25 g/L	Por ácido	0,25x	0,5x	8,01x	Palmer
Vitaminas		-	-	-	-	-	1x	1x	Gallagher
Traços de metais		-	-	-	-	1x	1x	1x	Flynn
Gema		0.25%	0.25%	0.25%	-	-	0.25%	0.25%	Kirchner
Ferritina		0,0003 g/L	-	-	-	-	0,0004 g/L	0,0004 g/L	Gallagher
DNA de esperma de salmão		1,4 g/L	4 g/L	4 g/L	-	-	1,4 g/L	-	-
DPTA		-	-	0,0059 g/L	-	-	-	-	-
ph		-	6.9	-	6.8	-	-	6.3	Lapierre
Armazenamento		0	4°	-	-	4°	4°	4°	Kirchner
Esterilização		Autoclave	Filtro	Autoclave	-	Autoclave	Autoclave	Filtro	Kirchner

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de vitaminas BME (100x)	MilliporeSigma	B6891	Solução concentrada de vitaminas suplementares.
Crimpador, 30 mm	DWK Ciências da Vida	224307	Crimpador para anexar selos de alumínio a frascos de soro.
D-(+)-Glicose	MilliporeSigma	G7021	Glicose sólida em pó (isómero dextrógiro).
Bomba de diafragma ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	Bomba de vácuo para filtração a vácuo.
Emulsão de gema de ovo	HiMedia	FD045	Emulsão estéril de gema de ovo a 30% em solução salina.
Ferritina catiônica do baço de cavalo	MilliporeSigma	F7879	Solução de ferritina (proteína de armazenamento de ferro).
Bico de Bunsen de Segurança FIREBOY plus	Integra Biociências	144000	Bico de Bunsen com interface de usuário e recursos de segurança.
Papel de pH Hydrion (1,0–14,0)	Laboratório Micro Essencial	94	Papel de teste de pH para a faixa de 1,0 a 14,0.
Papel de pH Hydrion (4,0–9,0)	Laboratório Micro Essencial	55	Papel de teste de pH para a faixa de 4,0 a 9,0.
Papel de pH Hydrion (6,0–8,0)	Laboratório Micro Essencial	345	Papel de teste de pH para a faixa de 6,0 a 8,0.
Dispositivo de segurança hipodérmico Needle-Pro EDGE, 18 g	Smiths Médico	401815	Agulhas de 18 G com tampas de segurança.
Manômetro em linha	MilliporeSigma	20469	Manômetro de gás para monitorar a pressão da garrafa.
Agitador Incubado Innova 42	Eppendorf	2231000756	Combinação incubadora/agitador orbital.
Seringa Luer-Lok com Agulha Acoplada	Becton Dickinson	309580	Seringa combinada de 3 mL e agulha de 18 G.
Variedade de válvulas Luer	Instrumentos de precisão mundiais	14011	Válvulas para tubulação de fluxo de gás.
Agitador Orbital LSE	ThermoFisher Scientific	6780-NP	Agitador orbital para agitar o meio durante a filtração.
Sulfato de magnésio heptahidratado	MilliporeSigma	M2773	Sal de epsom sólido (sulfato de magnésio heptahidratado).
Regulador de estágio único de ar médico com medidor de vazão	Empresas Ocidentais	M1-346-15FM	Regulador de caudal de ar com medidor de 15 L/min.
Solução de Aminoácidos MEM (50x)	MilliporeSigma	M5550	Solução concentrada de aminoácidos essenciais.
Solução de Aminoácidos Não Essenciais MEM (100x)	MilliporeSigma	M7145	Solução concentrada de aminoácidos não essenciais.
Filtro Millex-GP, 0,22 μm	MilliporeSigma	SLMP25SS	Filtro de seringa estéril de membrana de polietersulfona de 0,22 μm.
Milli-Q Acadêmico	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Sistema de filtragem de água estéril Milli-Q.
Monitor de oxigênio MiniOX 3000	MSA	814365	Monitor de porcentagem de oxigênio de fluxo de gás.
Tampão MOPS (1 M, pH 9,0)	Boston BioProdutos	BBM-90	Buffer MOPS para ajustar o pH do meio.
Mucina de estômago suíno	MilliporeSigma	M2378	Mucina (proteína formadora de gel glicosilada) em pó.
Cloreto de potássio	MilliporeSigma	Pág. 9541	sal sólido de cloreto de potássio.
Barras de agitação descartáveis de PTFE	ThermoFisher Scientific	14-513-95	Barras de agitação magnéticas descartáveis.
Fita de Teflon de vedação de rosca de PTFE	VWR	470042-938	Fita de teflon para reforçar as conexões do sistema de gás.
Cartucho de purificação Q-Gard 2	MilliporeSigma	QGARD00D2	Cartucho de purificação para sistema Milli-Q.
Garrafas de armazenamento de mídia reutilizáveis	ThermoFisher Scientific	06-423A	Frascos para misturar e armazenar meios de cultura.
Rolha de borracha, 30 mm, Bromobutilo cinzento	DWK Ciências da Vida	224100-331	Rolhas de borracha para frascos de soro.
Frasco de Soro com Graduações Moldadas, 500 mL	DWK Ciências da Vida	223952	Frascos de soro de vidro para cultura selada.
Conjunto de extensão de furo pequeno	Braun Medical	471960	Extensão da tubulação com conectores luer lock.
Cloreto de sódio	MilliporeSigma	S3014	Sal sólido de cloreto de sódio.
Mistura de Metais Traços, 1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	Solução concentrada de metais traços fisiológicos.
Vedação de alumínio sem revestimento, 30 mm	DWK Ciências da Vida	224187-01	Vedações de alumínio cravadas em cima de rolhas de borracha.