Quantificação de unidades formadoras de colônias de bactérias associadas ao intestino em moscas Drosophila

Resumo

Fonte: Dodge, R., et al. Contagem rápida de unidades formadoras de colônias em formato de placa de 96 poços aplicada ao microbioma de Drosophila . J. Vis. Exp. (2023)

Este vídeo demonstra a quantificação de unidades formadoras de colônias (UFCs) de bactérias associadas ao intestino em moscas Drosophila usando uma abordagem de diluição e plaqueamento em série. Amostras homogeneizadas de moscas contendo bactérias intestinais são diluídas em série, plaqueadas em ágar e incubadas para permitir o crescimento da colônia. As imagens das placas são então analisadas usando software para alinhar, segmentar e contar colônias em cada ponto, permitindo a quantificação precisa da UFC.

Protocolo

1. Homogeneização de moscas individualmente em uma placa de PCR de 96 poços

1. Prepare as placas batedoras de contas com antecedência.
   1. Despeje esferas de vidro de 0.5 μm (consulte a Tabela de Materiais) na bandeja medidora de contas. Espalhe as contas na bandeja para que todos os poços fiquem cheios e nivelados e, em seguida, escove o excesso de contas em um tubo cônico para recuperá-las.
   2. Coloque uma placa de reação em cadeia da polimerase (PCR) semi-contornada (consulte a Tabela de Materiais) de cabeça para baixo na bandeja de medição e alinhe-a com os poços, encaixando-a no recuo da bandeja. Em seguida, vire-o rapidamente para transferir as contas.
   3. Remova o excesso de grânulos da superfície da placa de PCR e cubra-a com papel alumínio. Inspecione a placa PCR para garantir que todos os poços contenham esferas. Use uma colher de pesagem, se necessário, para adicionar contas a um único poço. Se a eletricidade estática estiver fazendo com que os grânulos grudem nas superfícies da placa, limpe ou borrife a parte de trás da bandeja de medição e da placa PCR com etanol a 70%.
   4. Cubra com papel alumínio. Muitas placas podem ser preparadas dessa maneira e, em seguida, autoclavadas e armazenadas para uso posterior. Quando estiver pronto para uso, adicione 100 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a cada poço usando o pipetador de 96 canais (consulte a Tabela de Materiais).
2. Esterilize a superfície das moscas colonizadas por micróbios com 70% de etanol antes da homogeneização.
   1. Anestesiar as moscas com 100% de CO₂ por 5 s. Transfira as moscas anestesiadas do frasco para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando um pequeno funil (Figura 1A-2). Neste estudo, 25 moscas foram normalmente adicionadas por tubo.
   2. Pulverize imediatamente ~ 1 mL de etanol a 70% no tubo, feche o tubo e misture por inversão por 10 s. Em seguida, aspire o etanol com uma pipeta P1000, tomando cuidado para não aspirar moscas. Repita mais uma vez com etanol e depois duas vezes com PBS estéril (Figura 1A-3).
3. Após a lavagem final do PBS, feche o tubo e, com a tampa voltada para baixo, bata com força algumas vezes na bancada para que as moscas entrem na tampa.
4. Abra o tubo e dispense as moscas nos poços usando uma pinça (Figura 1A-4). Coloque uma mosca em cada poço (Figura 1A-5). Mantenha a placa no gelo durante o carregamento para manter as moscas anestesiadas.
5. Sele a placa usando uma folha de selagem térmica Thermal Bond (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Primeiro, remova quaisquer contas perdidas que estejam próximas aos poços, pois podem causar vazamentos na vedação da folha. Certifique-se de que o lado opaco da folha esteja orientado para baixo na placa e o lado brilhante para cima em direção ao selador térmico. Pressione o selador térmico (consulte a Tabela de Materiais) firmemente para baixo por 5 s (Figura 1A-6). Faça o polimento com o aplicador manual (consulte a Tabela de Materiais) para prender o papel alumínio.
      NOTA: A má vedação é uma causa de perda de amostra.
6. Prenda a placa no agitador de placas. Homogeneizar por 5 min (Figura 1A-7). Gire a placa do cordão por 30 s em um mini-girador de placa (consulte a Tabela de Materiais) a 350 x g para remover o líquido da folha de vedação.
7. Remova o papel alumínio enquanto segura a placa para não espirrar gotículas de homogeneizado de mosca para fora dos poços.

2. Diluição em série de homogenato de mosca e mancha em placas de UFC

1. Coloque quatro placas retangulares de crescimento de ágar de Man, Rogosa e Sharpe (MRS) (consulte a Tabela de Materiais) no gabinete de biossegurança e remova suas tampas. Neste protocolo, o ágar MRS foi utilizado para o crescimento de L. plantarum. Deixe essas placas secarem por pelo menos 10 minutos (20 minutos se forem recém-derramadas ou frias do armazenamento).
   NOTA: Se as placas estiverem molhadas, as gotículas da placa de 96 poços correrão juntas e arruinarão as contagens.
2. Preparar três placas de diluição adicionando 100 μL de PBS a cada alvéolo de uma placa estéril de 96 poços, utilizando um pipetador de 96 canais. Carregue um rack de pontas P20 no pipetador de 96 canais.
3. Fazer uma diluição de 1:10 aspirando 11,1 μl de homogenato da placa de amostra preparada na secção 1 (figura 1A-8). Certifique-se de extrair do meio dos poços em vez do fundo dos poços, porque o homogeneizado de moscas e as contas de vidro entupirão as pipetas. As contas afundam e as partículas da mosca flutuam, deixando a camada intermediária quase limpa.
4. Dispensar os 11,1 μL na primeira placa de diluição, que já contém 100 μL de PBS estéril por alvéolo. Manter a placa de diluição no agitador de placas durante 10 s a 600 rotações por minuto (rpm). Misture novamente pipetando para cima e para baixo por cinco ciclos. Transferir 11,1 μl da primeira placa de diluição para a segunda placa de diluição e repetir as etapas de mistura para as duas placas de diluição seguintes.
5. Efectuar o revestimento em série de diluição conforme descrito a seguir.
   1. Recupere as placas de crescimento do gabinete de biossegurança.
   2. Começando com a placa mais diluída, coloque 2 μL de cada poço nas placas de ágar usando o pipetador de 96 poços (Figura 1A-9).
      1. Abaixe a cabeça do pipetador lentamente sobre a placa, tomando cuidado para não esfaquear o ágar. Examine a placa cuidadosamente e certifique-se de que todos os pontos foram dispensados; caso contrário, adicione manualmente 2 μL à posição apropriada. Verifique se as manchas de líquido penetram rapidamente no ágar e não escorrem juntas.
      2. Se as manchas correrem juntas, seque um novo conjunto de placas de ágar frescas por um período mais longo e refaça a mancha. Se houver vários tipos de placas (por exemplo, meios diferentes ou com antibióticos), identifique-os também. Distribuir a solução restante de volta para a placa de diluição e prosseguir para a concentração imediatamente superior.
         NOTA: Ao detectar diluições, misture a próxima diluição cinco vezes para garantir que o conteúdo das pontas da pipeta seja limpo da diluição anterior. As placas de diluição podem ser armazenadas durante >8 h a 4 °C sem afectar o número de colónias.
6. Repetir o processo de plaqueamento conforme descrito no passo 2.5 para as restantes placas de diluição, passando da mais diluída para a mais concentrada até à placa com o homogeneizado original.
7. Quando todo o líquido tiver sido absorvido pelo ágar, inverta as placas e coloque-as na incubadora (Figura 1A-10). Para Lactiplantibacillus e Acetobacter de Drosophila, a temperatura ideal é de 30 °C em meios MRS. Incubar até que as colônias atinjam o tamanho ideal: as colônias são grandes o suficiente para vê-las claramente, mas não tão grandes que se fundam ou interfiram no crescimento umas das outras (veja os resultados representativos para quantificação do tamanho ideal).
   NOTA: As condições ideais de crescimento dependem da tensão e devem ser determinadas empiricamente. Para Lactiplantibacillus de Drosophila, o tempo ideal de incubação é de 26 h a 30 h em ágar MRS. Para Acetobacter de Drosophila, o tempo ideal de incubação é de 30 h a 48 h na MRS, dependendo da cepa.
8. Após a incubação, conservar as placas a 4 °C, se necessário, até estarem prontas para a contagem.

3. Quantificação de unidades formadoras de colónias (UFC)

1. Quantifique as UFC fotografando as placas e contando as colônias usando um software automatizado, conforme detalhado abaixo. Se as placas foram armazenadas a 4 °C, primeiro deixe-as atingir a temperatura ambiente para que não haja condensação nas placas, o que produz ofuscamento.
2. Organize as placas em uma sequência lógica e mantenha-as nessa ordem enquanto fotografa - isso facilita a nomeação dos arquivos. Oriente todas as placas de forma que A1 fique no canto superior esquerdo para todas as placas. Recomenda-se rotular o canto A1 com um ID exclusivo para garantir que não haja confusão nas fotos. Empilhar cada série de diluição por ordem.
3. Remova a tampa da placa e coloque a placa no palco com A1 orientado no canto correto. A caixa de fotos da placa é otimizada para fotografar essas placas de bandeja e inclui opções de iluminação e filtro para criar imagens de colônias fluorescentes.
4. Imagem das placas. Use a câmera (consulte a Tabela de Materiais) com configurações manuais para obter um nível de exposição consistente entre as placas. Recomenda-se uma configuração de distância focal longa para minimizar a distorção da perspectiva. Capture a foto usando um obturador remoto para minimizar o desfoque da trepidação da câmera.
5. Transfira as imagens para um computador e renomeie-as, incluindo o nome do experimento, o tipo de mídia, o fator de diluição e quaisquer outros detalhes pertinentes. Alguns sistemas operacionais (consulte Tabela de materiais) têm um recurso útil de renomeação em lote no Finder clicando com o botão direito do mouse em uma seleção de arquivos.

4. Contagem automatizada de colônias usando o pacote Count-On-It

1. Corte as imagens usando o plug-in Croptacular fornecido para ImageJ. Este plug-in ajuda a dividir a imagem em uma matriz ordenada de sub-regiões (por exemplo, 8 x 12 para uma placa de 96 poços). As sub-regiões serão contadas individualmente.
   1. Organize as imagens a serem processadas para quantificação em uma pasta. Escolha nomes de arquivo que distingam as placas, pois esses nomes de arquivo se tornam títulos de coluna para cada conjunto de contagens. Dentro desta pasta, crie subpastas chamadas "cortado" e "recibos".
   2. Inicie o Croptacular e clique em OK para iniciar o corte.
      NOTA: As configurações padrão são exibidas e geralmente são suficientes. Dependendo da resolução da imagem, da iluminação, do tamanho do ponto, etc., pode ser útil ajustar os parâmetros básicos.
   3. Se a imagem já estiver reta, basta pressionar Espaço. Caso contrário, endireite a imagem desenhando uma linha ao longo de uma borda que deve ficar horizontal. Redesenhe a linha quantas vezes forem necessárias se a imagem ainda não parecer endireitada.
   4. Em seguida, desenhe uma caixa de limite da área para a qual a contagem deve ser feita. Ajuste o tamanho e a proporção até que todos os pontos estejam dentro de suas células. Arraste o cursor para fora da caixa de limite para atualizar a grade. Quando a grade estiver boa, pressione Espaço.
   5. Certifique-se de que a próxima imagem gire automaticamente para o mesmo ângulo que a primeira; O plug-in assume que todas as fotos estão alinhadas da mesma forma. Se isso for preciso, pressione Espaço para continuar. Caso contrário, endireite a imagem como antes. A grade também lembra a mesma posição da imagem anterior; ajuste se necessário e pressione Espaço.
2. Enumere as colônias nas placas usando o plug-in Count-On-It: Gridiron fornecido para ImageJ.
   1. Inicie o Count-On-It > Gridiron. Use as mesmas configurações de grade do Croptacular. Os usuários podem agrupar uma pasta inteira, analisar uma única imagem ou começar a partir da imagem atual.
   2. Defina o limite com base em um valor de intensidade de pixel superior e inferior. Torne o limite o mais rigoroso possível enquanto ainda seleciona todas as colônias. Idealmente, haverá algum espaço entre as colônias selecionadas, mas o software é capaz de segmentar as bolhas até certo ponto. Clique em OK na caixa de diálogo "Ação necessária" quando o limite for satisfatório.
   3. Para inspecionar os resultados, amplie e observe mais de perto as contagens de colônias. Clicar em cancelar abortará o plug-in. Clique em OK para continuar.
   4. Na primeira imagem, certifique-se de que a opção seja fornecida para prosseguir ou retornar ao menu de configuração, por exemplo, para alterar o tamanho mínimo da colônia. Para prosseguir com o processo em lote, clique em OK. Em seguida, selecione uma pasta para manter a tabela de recibos e resultados. Use a pasta "recibos" ou crie uma nova pasta.
   5. Após a primeira imagem, as próximas imagens terão como padrão o mesmo limite das configurações anteriores. Clique em OK para usar essas configurações ou ajustá-las. Se as fotos forem consistentes e a configuração for precisa, clique em OK na caixa de diálogo "Ação necessária".
      NOTA: Depois que todas as imagens do lote forem concluídas, a tabela de resultados será salva automaticamente na mesma pasta dos recibos.
   6. Revise os recibos de contagem produzidos pelo software e corrija manualmente os erros de contagem. O plug-in ImageJ é estatisticamente preciso, mas ocorrem erros. Prove os recibos para examinar valores discrepantes e identificar erros de contagem. O software salva os dados da UFC como um arquivo .csv na mesma pasta dos recibos.
3. Analise os dados usando o software preferido do usuário.

Resultados

Figura 1: O ensaio de colonização mede UFCs em centenas de moscas individuais usando um formato de placa de 96 poços. (A) Visão geral pictórica do ensaio de colonização e método de quantificação de alto rendimento usado confor...

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