Tratamento de bactérias com exsudatos de raízes de plantas para emular interações planta-micróbio in vitro

Resumo

Fonte: Yi, Y., et al. Interação planta-micróbio: resposta transcricional de Bacillus mycoides ao exsudato da raiz da batata J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a preparação e o tratamento de culturas de Bacillus mycoides para estudar as interações planta-micróbio. Ele descreve as etapas desde a risca de uma cultura de estoque e incubação em meio líquido até a exposição das bactérias aos exsudatos radiculares das plantas sob agitação. O processo culmina na colheita e congelamento instantâneo das células bacterianas para posterior análise das alterações na expressão gênica induzidas pelos exsudatos.

Protocolo

1. Bactérias em crescimento

1. Listre uma cepa de B. mycoides de um estoque de glicerol a -80 ° C em uma placa de ágar Luria-Bertani (LB) e incube a placa a 30 ° C durante a noite.

2. Inocule um meio líquido LB com uma única colônia da placa e cultive a cultura em uma incubadora agitada a 200 rpm durante a noite em
30 °C.

2. Tratamento e amostragem de bactérias

1. Para comparar a curva de crescimento das bactérias tratadas com exsudatos radiculares com um controle negativo, prepare uma série de frascos contendo 50 mL de meio líquido LB. Adicione 0,5 mL da cultura bacteriana durante a noite a todos os frascos e adicione 0%, 5%, 10% ou 15% (v / v) de exsudato radicular ou água deionizada estéril ao meio, respectivamente.

2. Use uma cultura com água deionizada em vez de exsudatos radiculares como controle. Meça a densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) a cada 1 h em seguida. Gere uma curva de crescimento plotando os valores de OD₆₀₀ em relação ao tempo.

3. Diluir uma cultura de B. mycoides durante a noite com 90 mL de meio LB pré-aquecido até um OD₆₀₀ inicial de ~ 0,05 em um frasco de 300 mL. Adicionar 10 ml de exsudados radiculares à cultura e incubá-la a 30 °C durante 1 h.

4. Use um tratamento de água deionizada estéril de 10 mL como controle. Coletar células da cultura por centrifugação a 9.000 x g por 2 min a 4 ° C. Descarte o sobrenadante e congele imediatamente o pellet em nitrogênio líquido e armazene-o a -80 ° C até o uso.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Hipoclorito de sódio	Sigma	CAS: 7681-52-9	10-15% de cloro ativo
Caldo Luria-Bertani (LB)
Incubar	Científico de New Brunswick	Innova 4000
Espectrofotômetro	Thermo Fisher Científico	Genesys 20
Nitrogênio líquido
Contas de vidro	Sigma	G8893	0,5 μm
Tubo de 2,0 ml com tampa de rosca			Livre de RNase
Tubo Eppendorf de 1,5 ml e 2,0 ml			Livre de RNase
Centrifuga	Eppendorf	5430