Ensaio de crescimento bacteriano limitado por metais para estudar o papel de genes responsivos a metais

Resumo

Fonte: Maurakis, S., et al. Crescimento limitado por metal de Neisseria gonorrhoeae para caracterização de genes responsivos a metais e aquisição de metais de ligantes hospedeiros. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra um ensaio de crescimento bacteriano limitado a metais para estudar o papel dos genes responsivos a metais. Bactérias selvagens e mutantes cultivadas em meio empobrecido em metal são incubadas com ligante de metal e seu crescimento é monitorado usando um leitor de placas. Em condições de esgotamento de metais, as bactérias do tipo selvagem expressam um receptor de superfície que permite a absorção e o crescimento do metal, enquanto o mutante não possui esse receptor, resultando em crescimento restrito.

Protocolo

1. Preparação de soluções de estoque de meio definido (MDL) tratadas com Chelex

1. Solução de estoque I
   1. Combine cloreto de sódio ou NaCl (233,8 g), sulfato de potássio ou K₂SO₄ (40,0 g), cloreto de amônio ou NH₄Cl (8,8 g), hidrogenofosfato dipotássico ou K₂HPO₄ (13,9 g) e di-hidrogenofosfato monopotássico ou KH₂PO₄ (10,9 g) em água deionizada até um volume final de 1 L.
   2. Filtre a solução e alíquota em tubos cônicos de 50 mL.
   3. Conservar a -20 °C.
2. Solução de reserva II
   1. Combine ácido clorídrico de tiamina ou HCl (0,2 g), pirofosfato de tiamina-Cl (0,05 g), pantotenato de cálcio (0,19 g) e biotina (0,3 g) em etanol a 50% (vol/vol) até um volume final de 1 L.
   2. Alíquota em tubos cônicos de 50 mL e armazenar a -20 °C.
3. Solução de reserva III
   1. Combine L-aspartato (4,0 g), L-glutamato (10,4 g), L-arginina (1,2 g), glicina (0,2 g), L-serina (0,4 g), L-leucina (0,72 g), L-isoleucina (0,24 g), L-valina (0,48 g), L-tirosina (0,56 g), L-prolina (0,4 g), L-triptofano (0,64 g), L-treonina (0,4 g), L-fenilalanina (0,2 g), L-asparagina-H₂O (0,2 g), L-glutamina (0,4 g), L-histidina-HCl (0,2 g), L-metionina (0,12 g), L-alanina (0,8 g), L-lisina (0,4 g) e glutationa reduzida (0,36 g) em 500 mL de água deionizada.
   2. Dissolva a L-cisteína (0,44 g) e a L-cistina (0,28 g) em um volume mínimo (~ 1 mL) de 1 M HCl e adicione à solução de aminoácidos acima.
   3. Ajustar o pH da solução com hidróxido de sódio (NaOH) 10 N até que todas as partículas estejam dissolvidas. O pH final será de 10,0 a 11,0.
   4. Traga o volume final para 1 L com água deionizada.
   5. Filtre a solução e alíquota em volumes de 250 mL.
   6. Conservar a -20 °C.
4. Solução de reserva IV
   1. Dissolva a glicose (200 g) em água deionizada até um volume final de 1 L.
      NOTA: A solução pode ter que ser aquecida para dissolver a glicose.
   2. Filtre-esterilize e alíquota da solução em tubos cônicos de 50 mL.
   3. Conservar a -20 °C.
5. Solução de reserva V
   1. Combine hipoxantina (5,0 g), uracila (5,0 g) e NaOH (4,0 g) em água deionizada até um volume final de 1 L.
   2. Filtre, esterilize e alíquota em tubos cônicos de 50 mL.
   3. Conservar a -20 °C.
6. Solução VI
   1. Prepare uma solução de cloreto de cálcio 1 M di-hidratado ou CaCl 2-2H₂O (147 g/L) em água deionizada. Filtre, esterilize e armazene em temperatura ambiente (RT).
7. Solução de reserva VII
   1. Prepare uma solução de sulfato de magnésio anidro 1 M (MgSO₄) em água deionizada. Filtre, esterilize e armazene em RT.
8. Solução de reserva VIII
   1. Preparar uma solução de bicarbonato de sódio (NaHCO₃) 1 M em água desionizada. Filtre, esterilize e armazene em RT.

2. Preparação de 4x Concentrado Estéril e 1x CDM

NOTA: Este procedimento deve ser realizado em vidraria estéril tratada com ácido ou plástico para evitar a lixiviação de metais nas soluções.

1. Combine as soluções-mãe I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 mL) e V (20 mL) com 20,0 g de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) e misture bem.
2. Ajuste o pH para 7,4 e, em seguida, traga o volume final para 500 mL com água deionizada.
3. Lave a resina Chelex-100 em 1 L de água deionizada para remover os conservantes antes de adicioná-la ao concentrado estéril 4x. Faça isso adicionando 50 g de resina a 1 L de água deionizada e mexendo por pelo menos 1 h. Remova a água por filtração a vácuo e use esta resina lavada para a etapa 2.4.
4. Adicione 50 g de resina e mexa lentamente por exatamente 90 min.
5. Remova a resina por esterilização por filtro e armazene o concentrado estéril 4x a 4 °C.
6. Para preparar uma concentração de trabalho 1x de MDL, primeiro dilua o concentrado 4x com água deionizada estéril e, em seguida, adicione a solução VI (125 μL por 500 mL de solução 1x), solução VII (535 μL por 500 mL) e solução VIII (10 mL por 500 mL).
   NOTA: Embora todas as soluções de estoque já tenham sido esterilizadas, recomenda-se filtrar-esterilizar a solução 1x novamente após o preparo.

3. Preparação de placas de MDL

NOTA: A receita abaixo rende 1 L de mídia para pratos, mas é melhor prepará-los em volumes menores. Tudo diminui proporcionalmente.

1. Agarose lavada
   1. Dissolver 50 g de agarose em 1 L de água desionizada, mexendo durante 1 h.
   2. Transferir a solução para um frasco de centrifugação e centrifugar a 1.200 x g durante 15 min em RT. Deite cuidadosamente o sobrenadante e elimine.
   3. Adicionar água desionizada suficiente para ressuspender o sedimento de agarose e, em seguida, transferir para um balão de 1 l. Levar até um volume final de 1 L com água desionizada e, em seguida, agitar e centrifugar como no passo 3.1.2. Descarte o sobrenadante.
   4. Adicionar etanol a 100% suficiente para ressuspender o sedimento e, em seguida, transferir para um novo balão de 1 l. Levar a um volume final de 1 L com etanol. Agitar e centrifugar como no passo 3.1.2.
   5. Repita a etapa 3.1.4.
   6. Adicionar metanol ao sedimento de agarose para ressuspender e transferir para um balão de 1 l. Levar a um volume final de 1 L com metanol. Agitar e centrifugar como no passo 3.1.2.
   7. Repita a etapa 3.1.6.
   8. Transfira o agarose lavado para uma bandeja forrada com papel alumínio e deixe secar em uma coifa. Quando seco, transfira para um recipiente sem metal para armazenamento de longo prazo.
2. Adicione 10 g de agarose lavada e 5 g de fécula de batata a 750 mL de água deionizada.
3. Autoclave por 30 min a 121 °C, 100 kPa acima da pressão atmosférica.
4. Deixe o meio esfriar até ~ 65 ° C e, em seguida, adicione 250 mL de 4X CDM, 250 μL de solução VI, 1,07 mL de solução VII e 20 mL de solução VIII.
5. Se desejar, adicione os metais de sua escolha antes de despejar as placas. A adição de quelantes não é necessária para manter condições livres de metais.
6. Despeje em placas de Petri e deixe solidificar.

4. Crescimento limitado de metais de Neisseria gonorrhoeae

NOTA: Para a maioria das aplicações, não é necessário estressar as bactérias antes da inoculação do MDL. A etapa inicial de duplicação no MDL e a diluição subsequente são suficientes para esgotar os gonococos de seus estoques internos de ferro e zinco. Como tal, as duas primeiras etapas do procedimento a seguir são conduzidas usando placas de ágar feitas de base média Gonococcus (GC) que foram suplementadas com suplemento I da Kellogg's e nitrato férrico de 12,5 μM (Fe (NO₃) ₃). Se o estresse inicial do metal for desejado, recomendamos a preparação de placas de base médias GC sem Fe(NO₃)₃ e com 5 μM TPEN (N,N,N',N'-tetraquis(2-piridilmetil) etilenodiamina) para quelação de zinco ou 10 μM de desferroxamina para quelação de ferro. Toda a incubação é realizada a 37 °C com 5% de CO₂.

1. Dois dias antes do experimento, no dia -2, retire os gonococos dos estoques do freezer para placas médias de GC e incube por não mais que 24 h.
2. No dia -1, coloque colônias únicas em placas médias de GC frescas. Tente fazer isso 14 a 16 h antes do experimento de crescimento.
3. No dia do experimento, adicione 5 a 10 mL 1x CDM a um frasco de pistola defletora de 125 mL lavado com ácido e use-o para apagar um colorímetro Klett.
4. Use um cotonete estéril com ponta de algodão para inocular o MDL de colônias únicas e saudáveis. Apontar para 20 unidades Klett.
   NOTA: Se um colorímetro Klett não estiver disponível, um espectrofotômetro também é adequado. Não existe uma fórmula de conversão universal para unidades Klett para OD, mas um guia aproximado está disponível (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
5. Incubar com agitação a 250 rpm até aproximadamente uma massa duplicar (40 unidades Klett). Isso deve levar entre 1 e 2 horas.
6. Nesse ponto, as culturas são diluídas novamente pela adição de um volume suficiente de MDL para atingir metade da densidade inicial da cultura (por exemplo, se 5 mL de cultura passaram de 20 para 40 unidades de Klett, 15 mL de MDL o reduzirão para 10 unidades de Klett) e o crescimento continuará como na etapa 4.5. A quantidade específica de retrodiluição, tratamentos de metal, etc., depende das aplicações a jusante. Damos três exemplos abaixo

5. Ensaios de crescimento limitados por metais

NOTA: Esses ensaios descrevem pré-misturas de crescimento pré-fabricadas. A preparação destas misturas é descrita no ponto 6.

1. Durante a duplicação da massa na etapa 4.5, pré-trate os poços de uma microplaca de 96 poços com 10x pré-misturas. Além disso, designe três poços para servir como espaços em branco. A esses poços, adicione 10 μL de pré-mistura 10x e 90 μL de MDL.
2. Uma vez duplicadas as culturas nos frascos da pistola, adicionar 100 μl de cada cultura a um alvéolo não utilizado na microplaca e medir a densidade óptica a 600 nm (OD600). Isso pode ser feito com cubetas em um espectrofotômetro, mas com um número maior de cepas dentro de um ensaio, isso pode se tornar complicado e geralmente não é recomendado, a menos que seu espectrofotômetro possa medir diretamente do braço do frasco do braço lateral.
   1. Enquanto mede a DO, coloque os frascos de volta na incubadora para garantir que os gonococos permaneçam viáveis.
3. Calcule a quantidade correta de diluição necessária para levar as culturas a OD600 = 0,02. As pré-misturas 10x têm um efeito insignificante no OD e podem ser omitidas do cálculo.
4. Dilua as culturas com MDL em pequenos tubos de cultura e adicione volume suficiente para diluir as pré-misturas 10x para 1x na placa. Se estiver disponível um aquecedor de pratos, mantenha o prato a 37 °C durante o trabalho.
5. Incube a placa por 8–12 h agitando em um leitor de placas, fazendo medições OD600 nos intervalos desejados.

6. Carregamento de metal de transferrina, S100A7 e calprotectina e preparação de 10 pré-misturas

NOTA: Tal como acontece com a preparação do MDL, use vidro ou plástico lavado com ácido para a preparação da solução.

1. Dissolva a transferrina humana a 10 mg / mL (125 μM) no tampão inicial (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO₃, pH = 8,4). S100A7 e calprotectina são suspensos em um tampão consistindo de 20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 10 mM de 2-mercaptoetanol e 1 mM de cloreto de cálcio ou CaCl₂, pH = 8,0).
   1. Adicione solução de ferração (citrato de sódio 100 mM, NaHCO₃ 100 mM, cloreto de ferro (III) hexahidratado 5 mM ou FeCl_{3-6H 2}O, pH = 8,4) à solução de transferrina para atingir 30% de saturação de ferro (por exemplo, 75 μL de solução de ferração é adequado para 5 mL de transferrina se feito a 10 mg / mL).
   2. Adicione sulfato de zinco (ZnSO₄) a S100A7 ou calprotectina a uma proporção molar de 50% à proteína para criar 25% de saturação (cada molécula de proteína tem dois locais de ligação de metal). Podem ser utilizadas preparações de 100 μM de S100A7 ou calprotectina com 50 μM de ZnSO₄ .
   3. Para ambos os casos, permita a mistura de ponta a ponta por pelo menos 1 h para carregamento de metal.
2. Prepare 4 L de tampão de diálise (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO₃, pH = 7,4). Divida-o em dois volumes separados de 2 L e coloque um a 4 °C.
3. Adicione as proteínas carregadas de metal a um de diálise usando uma seringa e dialise contra o primeiro volume tampão por 4 h em RT.
4. Mova o para o segundo volume tampão e dialise durante a noite a 4 °C. Após essas etapas, todos os metais não ligados devem ser removidos.
   NOTA: Aconselhamos um ensaio de ácido bicinchonínico para determinar as concentrações de proteínas após a diálise.
5. Use uma pré-mistura de transferrina 10x para utilização de transferrina como única fonte de ferro.
   1. Prepare esta pré-mistura diluindo 30% de Fe-transferrina humana e apo-transferrina bovina (preparada a 125 μM conforme descrito para transferrina humana, sem a etapa de carregamento de ferro) a 75 μM e 30 μM, respectivamente, em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Uma pré-mistura de controle positivo substitui 30% de Fe-transferrina por 75 μM de Fe(NO)₃, e uma pré-mistura de controle negativo omite qualquer ferro adicionado, retendo apenas a apotransferrina bovina. No ensaio de crescimento, diluir 10 μL desses concentrados com 90 μL de cultura. As concentrações finais são de 7,5 μM de 30% de Fe-transferrina humana e 3 μM de apo-transferrina bovina.
6. Use uma versão modificada da pré-mistura de transferrina 10x para S100A7 ou utilização de calprotectina como única fonte de zinco.
   1. Para uma pré-mistura de controle positivo, incorpore 50 μM de ZnSO₄ na pré-mistura de transferrina. Para um controlo negativo, incorporar 50 μM de TPEN e omitir o zinco. Em seguida, pegue 10 μL de cada um deles para cada amostra bem necessária e mova esse volume para um novo tubo. Adicione a isso metade do volume de PBS estéril. Por exemplo, se 10 poços receberem a pré-mistura de controle positivo, pegue 100 μL de pré-mistura, mova-a para um novo tubo e adicione 50 μL de PBS. Faça o mesmo para o controle negativo.
   2. Para fazer a pré-mistura S100A7 ou calprotectina, pegue 10 μL da pré-mistura de controle negativo por poço necessário, passe para um novo tubo e adicione metade desse volume de 25% de Zn-S100A7 ou calprotectina. No ensaio de crescimento, use 15 μL de pré-mistura e dilua com 85 μL de cultura. As concentrações finais para as transferrinas permanecem as mesmas da etapa 8.5, com adição de 5 μM de Zn, TPEN ou S100A7/calprotectina.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Frascos de pistola de 125 mL	Bellco	2578-S0030	Deve ser encomendado sob encomenda
2-Mercaptoetanol	VWR	M131	Aberto na hotte
Papel 3MM	GE Saúde	3030-6461	Chamado de "papel de filtro" no texto
Agarose	Biolone	BIO-41025	Pó
Cloreto de amônio	Sigma-Aldrich	A9434	Pó
Transferrina bovina	Sigma-Aldrich	T1428	Pó
Cloreto de cálcio di-hidratado	Sigma-Aldrich	C5080	Pó
Pantotenato de cálcio	Sigma-Aldrich	C8731	Pó
Calprotectina	N/A	N/A	Somos fornecidos por um colaborador
Resina Chelex-100	Bio-Rad	142-2832	Lave com água deionizada antes de usar
Cotonete estéril com ponta de algodão	Puritano	25-806	O algodão é melhor que o poliéster para esta aplicação
Deferoxamina	Sigma-Aldrich	D9533	Pó
D-glicose	Sigma-Aldrich	G8270	Pó
para diálise	Thermo	66380	Mergulhe previamente no tampão antes de usar
Etanol	Koptec	V1016	Líquido inflamável, armazenar em armário de inflamáveis
Cloreto férrico	Sigma-Aldrich	F7134	Irritante, não inalar
Nitrato férrico nona-hidratado	Sigma-Aldrich	F1143	Irritante, não inalar
Base média GC	Difco	228950	Pó, já contém ágar
Glicina	Sigma-Aldrich	G8898	Pó
HEPES	Pescador	L-15694	Pó
Transferência humana	Sigma-Aldrich	T2030	Pó
Hipoxantina	Sigma-Aldrich	H9377	Pó
Colorímetro Klett	Manostato	37012-0000	Usa transmissão de cores para avaliar a densidade da cultura
L-alanina	Sigma-Aldrich	Rolamento A7627	Pó
L-arginina	Sigma-Aldrich	Rolamento A5006	Pó
L-asparagina monohidratada	Sigma-Aldrich	Rolamento A8381	Pó
L-aspartato	Sigma-Aldrich	A9256	Pó
Cloridrato de L-cisteína	Sigma-Aldrich	C1276	Pó
L-cistina	Sigma-Aldrich	C8755	Pó
L-glutamato	Sigma-Aldrich	G1251	Pó
L-glutamina	Sigma-Aldrich	G3126	Pó
Cloridrato de L-histidina	Sigma-Aldrich	H8125	Pó
L-isoleucina	Sigma-Aldrich	I2752	Pó
L-leucina	Sigma-Aldrich	L8000	Pó
L-lisina	Sigma-Aldrich	L5501	Pó
L-metionina	Sigma-Aldrich	M9625	Pó
L-fenilalanina	Sigma-Aldrich	Pág. 2126	Pó
L-prolina	Sigma-Aldrich	Pág. 0380	Pó
L-serina	Sigma-Aldrich	S4500	Pó
L-treonina	Sigma-Aldrich	T8625	Pó
L-triptofano	Sigma-Aldrich	T0254	Pó
L-tirosina	Sigma-Aldrich	T3754	Pó
L-valina	Sigma-Aldrich	V0500	Pó
Sulfato de magnésio	Sigma-Aldrich	M7506	Pó
Metanol	VWR	BDH1135-4LP	Líquido inflamável, armazenar em armário de inflamáveis
Fosfato de potássio dibásico	Sigma-Aldrich	60356	Pó
Fosfato de potássio monobásico	Sigma-Aldrich	Pág. 9791	Pó
Sulfato de potássio	Sigma-Aldrich	Pág. 0772	Pó
Amido de batata	Sigma-Aldrich	S4251	Pó
Glutationa reduzida	Sigma-Aldrich	G4251	Manuseie com cuidado. Pode oxidar facilmente.
S100A7	N/A	N/A	Somos fornecidos por um colaborador
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S5761	Pó
Cloreto de sódio	VWR	470302	Pó
Citrato de sódio	Pescador	S279	Pó
Hidróxido de sódio	Acros Orgânicos	383040010	Altamente higroscópico
Cloridrato de tiamina	Sigma-Aldrich	T4625	Pó
Pirofosfato de tiamina	Sigma-Aldrich	C8754	Também chamada de cocarboxilase
TPEN	Sigma-Aldrich	Pág. 4413	Pó
Tris	VWR	497	Pó
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750	Pó
Sulfato de zinco heptahidratado	Sigma-Aldrich	204986	Irritante, não inalar