Detecção dos transportadores de metais de superfície em Neisseria gonorrhoeae usando Dot Blot

Resumo

Fonte: Maurakis, S., e Cornelissen, C. N. Crescimento limitado por metais de Neisseria gonorrhoeae para caracterização de genes responsivos a metais e aquisição de metais de ligantes hospedeiros. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra o procedimento para detectar transportadores de metal de superfície em Neisseria gonorrhoeae cultivada sob condições limitadas por metal usando um ensaio de dot blot, envolvendo ligação de ligante, detecção de anticorpos e visualização colorimétrica.

Protocolo

1. Detecção de ligação de ligantes por transportadores de metal de membrana externa

1. Diluir as culturas com três volumes de MDL (meio definido tratado com quelex).
2. Em seguida, incubar com agitação por 4 h.
3. Pouco antes da marca de 4 h, corte três pedaços de papel de filtro e um pedaço de nitrocelulose no tamanho aproximado necessário para caber em um aparelho de mancha de pontos. Mergulhe a nitrocelulose em água desionizada e, em seguida, monte o aparelho com papel de filtro abaixo da nitrocelulose.
4. Às 4 h, registre as densidades celulares e padronize para uma densidade final apropriada.
5. Pipetar culturas de células para a nitrocelulose e dar tempo suficiente para que o papel de filtro absorva todo o líquido.
6. Desmontar o aparelho, deixar secar o borrão e bloquear a membrana de nitrocelulose por 1 h em albumina de soro bovino a 5% ou leite desnatado (p/v) em solução salina tamponada com Tris.
7. Remonte o aparelho de mancha de pontos, substituindo o papel de filtro por filme de parafina para criar uma vedação à prova de vazamentos sob a nitrocelulose.
8. Diluir o ligante de ligação ao metal de interesse a 0,2 μM em células bloqueadoras e de sonda durante 1 h.
9. Sifão o líquido com vácuo, lave a mancha e siga os procedimentos imunológicos padrão para desenvolver o sinal. As etapas de lavagem podem ser feitas dentro ou fora do aparelho.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Frascos de pistola de 125 mL	Bellco	2578-S0030	Deve ser encomendado sob encomenda
2-Mercaptoetanol	VWR	M131	Aberto na hotte
Papel 3MM	GE Saúde	3030-6461	Chamado de "papel de filtro" no texto
Bloqueador de grau de blotting	Bio-Rad	170-6404	Leite em pó desnatado
Albumina de soro bovino	Roche	3116964001	Pó
Calprotectina	N/A	N/A	Somos fornecidos por um colaborador
Resina Chelex-100	Bio-Rad	142-2832	Lave com água deionizada antes de usar
Cotonete estéril com ponta de algodão	Puritano	25-806	O algodão é melhor que o poliéster para esta aplicação
Aparelho de mancha de pontos	Schleicher & Schwell	10484138	Trave a tampa o mais firmemente possível antes do carregamento da amostra
Etanol	Koptec	V1016	Líquido inflamável, armazenar em armário de inflamáveis
Colorímetro Klett	Manostato	37012-0000	Usa transmissão de cores para avaliar a densidade da cultura
Metanol	VWR	BDH1135-4LP	Líquido inflamável, armazenar em armário de inflamáveis
Nitrocelulose	GE Saúde	10600002	Manter em bainha protetora até o uso
S100A7	N/A	N/A	Somos fornecidos por um colaborador
Cloreto de sódio	VWR	470302	Pó
Tris	VWR	497	Pó