Cultura de Haemophilus influenzae não tipável

Resumo

Fonte: Venuprasad, K. et. al., Administração intratraqueal de Haemophilus influenzae em modelos de camundongos para estudar a inflamação das vias aéreas. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a cultura de Haemophilus influenzae não tipável e a preparação de um inóculo padronizado por dose para estudos de colonização ou infecção a jusante.

Protocolo

1. Cultura de Haemophilus influenzae não tipável (NTHi) e preparação do inóculo

1. Coloque o NTHi em um prato de ágar chocolate e mantenha o prato de cabeça para baixo em uma incubadora de CO₂ umidificada durante a noite a 37 ° C e 5% de CO₂. No dia seguinte, cultive as bactérias em caldo de infusão cérebro-coração. Em seguida, adicione 1 ml do caldo em um tubo estéril de 1,5 ml.
2. Centrifugue a 4.000 x g por 5 min em temperatura ambiente. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 ml de solução salina estéril 1x tamponada com fosfato (PBS). Repita esta etapa uma vez.
3. Transferir 100 μl da solução ressuspensa para 900 μl de PBS 1x e medir a absorvância da cultura diluída no comprimento de onda de 600 nm num espectrofotómetro.
4. Determinar a viabilidade e as unidades formadoras de colónias (UFC) do inóculo cultivando diluições seriadas 1:10 em placas de ágar-chocolate e incubando durante a noite a 37 °C e 5% de CO₂.
5. Com base na viabilidade e nas UFC determinadas na etapa anterior, ajustar o inóculo para uma concentração final de 20 x 10⁶ UFC/ml.

Materiais