Medindo as taxas de tradução incorreta de Mycobacterium smegmatis usando um sistema repórter GFP/luciferase

Resumo

Fonte: Chen, Y., et al., Medição de Taxas Específicas de Tradução Incorreta de Micobactérias com Sistemas de Relatório de Ganho de Função. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra um método para quantificar erros de tradução em Mycobacterium smegmatis usando um GFP induzível e um sistema repórter de luciferase mutante secretada. Ele mostra como a luminescência resultante de erros de tradução é medida e comparada à fluorescência GFP para avaliar o impacto de uma molécula de teste na precisão da tradução.

Protocolo

1. Repórter de nanoluc luciferase (Nluc) / proteína fluorescente verde (GFP)

NOTA: Para obter uma representação visual desse método, consulte a Figura 1.

1. Inocular a estirpe repórter bacteriana a partir de stock de -80 °C com 2 ml de meio 7H9. Agitar a 37 °C durante 1 a 2 dias até que o OD₆₀₀ atinja a fase estacionária (OD >3).
2. Subcultive para 50 mL de meio 7H9 e cresça até que OD₆₀₀ atinja a fase estacionária tardia (>4).
3. Antes de aliquotar as bactérias para uma placa de 96 poços, adicione anidrotetraciclina (ATC) a uma concentração final de 50 ng/mL e misture bem. A indução da cultura em massa garante que todos os poços contenham a mesma quantidade de indutor e que a indução do repórter seja sincronizada. Aliquote as bactérias para uma placa transparente de fundo redondo de 96 poços, com 100 μL de volume em cada poço.
4. Para rastrear pequenas moléculas que afetam as taxas de tradução incorreta, adicione o composto na concentração indicada para selecionar os poços. Para os fins deste protocolo, use a kasugamicina (nas doses indicadas na Figura 2) como ilustração. Adicione diferentes doses de kasugamicina aos poços selecionados (cada grupo experimental deve conter pelo menos duas réplicas biológicas).
5. Agitar e induzir as amostras a 37 °C durante 16-20 h.
   NOTA: É necessário selar a placa com filme. Além disso, todos os poços de borda precisam ser preenchidos com pelo menos 200 μL de água estéril para limitar a evaporação dos poços de teste.
6. Pegue 80 μL de cada poço, usando uma pipeta multicanal, e transfira as amostras para uma placa preta de 96 poços (o que maximiza a medição do sinal de fluorescência). Meça o sinal GFP por luminômetro com 20 ms como tempo de integração.
7. Depois de medir o sinal GFP, centrifugue a placa a 3.220 x g por 10 min. Transfira 50 μL do sobrenadante para uma placa de fundo branco de 96 poços (o que maximiza a medição do sinal de luminescência), adicione 50 μL de substrato Nluc a cada poço, misture-os bem e meça a luminescência por luminômetro com 1.000 ms como tempo de integração.
8. Determine a razão Nluc/GFP dividindo os valores de luminescência Nluc corrigidos pela fluorescência GFP: esta medida (em unidades arbitrárias) é uma medida relativa de aspartato para erros de tradução da asparagina.

Resultados

Figura 1: Esboço da medição da taxa de tradução incorreta Nluc-GFP repórter. Uma nova cultura de M. smegmatis, transformada com os repórteres Nluc e GFP, é cultivada até um volume suficiente para que todas as placas sejam testadas (assum...

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