Coleta de fluido de lavagem broncoalveolar de um modelo de camundongo infectado com Haemophilus influenzae não tipável

Resumo

Fonte: Venuprasad, K., et al. Administração intratraqueal de Haemophilus influenzae em modelos de camundongos para estudar a inflamação das vias aéreas. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a coleta e o processamento do fluido de lavagem broncoalveolar de um camundongo sacrificado infectado com Haemophilus influenzae não tipável para análise a jusante.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Coleção de Fluido de Lavagem Broncoalveolar (BALF)
   1. Sacrifique o camundongo por luxação cervical 24 horas após a infecção.
   2. Abra a cavidade abdominal do camundongo com uma tesoura anatômica, corte a aorta ventral para sangrar e exponha a parte ventral do pulmão.
   3. Exponha a traqueia e intube-a com um cateter de calibre 20. Instilar 0,8 ml de tampão BALF (1x PBS (solução salina tamponada com fosfato), 0,1% dextrose, 10 U/ml de heparina) e coletar a lavagem por aspiração suave. Repita este procedimento três vezes.
   4. Conte o número total de células em 100 μl de suspensão de BALF usando um hemocitômetro com aumento de 10X com coloração com Trypan Blue.
   5. Prepare as lâminas para a coloração de Giemsa modificada. Alíquota de 100 μl de BALF nos poços apropriados da citospin e centrifugar a 500 x g por 5 min. Seque as lâminas por 10 min e core as células com coloração de Giemsa modificada de acordo com os protocolos do fabricante.
   6. As células restantes podem ser usadas para análises subsequentes, como classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), microscopia confocal, expressão gênica e western blot.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dextrose anidra	Themo Científico	R01300
Heparina	Hospira, Inc	RL-3010
Agulha para seringa 20/26G	BD	(REF305115/175)
Seringa de 1 ml	BD	REF 309602
Cateter 20GA	BD	REF 381433
Pinça #5 Aço inoxidável, 11cm de comprimento	Kentscientific	INS600095
Tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 ml	BD	REF 352058
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	Laboratórios de Luz	A-7001-R
1X PBS (solução salina tamponada com fosfato)	Gibco	10010-023
Tampão de lise de hemácias (10X)	Biolenda	420301