Sincronização de cultura de cianobactérias e compactação de DNA impulsionadas por ciclos claro-escuro

Resumo

Fonte: Murata, K. et. al., Visualização da compactação de DNA em cianobactérias por tomografia crioeletrônica de alta voltagem. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o cultivo síncrono de cianobactérias sob ciclos claro-escuro para estudar a compactação do DNA regulada pelo circadiano. A microscopia de fluorescência revela DNA condensado em pontos de tempo definidos, confirmando o alinhamento do ciclo celular em toda a população.

Protocolo

1. Cultura síncrona de cianobactérias

1. Cultura de Synechococcus elongatus PCC 7942 em uma placa esterilizada de meio azul-esverdeado 11 (BG 11) (em uma placa de Petri plástica estéril de 9 cm) contendo 1,5% (p / v) de ágar e 0,3% (p / v) de tiossulfato de sódio.
2. Colocar as placas numa câmara de crescimento a 23 °C com uma intensidade luminosa de 50 μE/m²/s e submetê-las a ciclos de 12 h de luz/12 h de escuridão.
3. Transfira as células para placas de ágar BG11 frescas uma vez por semana.
   NOTA: As culturas no ágar aparecerão como faixas verdes de células em proliferação ativa após uma semana nessas condições de cultivo.
4. Pegue aglomerados verdes de células com um laço de arame esterilizado por chama e listre as células em uma nova placa de ágar BG11. Faça isso em um banco limpo.

2. Monitoramento por microscopia de fluorescência

1. Use células cultivadas na placa de ágar por 6 dias para observar a compactação do DNA. Colete as células da placa no final do período de luz, despejando 1 mL de solução de sacarose 0,2 M sobre as células. Repita derramando a solução nas células para que a maioria das células seja coletada. Transfira a solução de células suspensas para um microtubo para coloração de DNA.
2. Adicione a solução de corante de coloração de DNA (por exemplo, Hoechst 33342) a 500 μL da solução de células suspensas em um microtubo até uma concentração final de 1 μg / mL. Em seguida, mantenha o tubo no escuro por 10 min.
3. Centrifugue por 1 min a 2.000 x g para sedimentar as células. Rejeitar o sobrenadante e adicionar 10 μL de solução de sacarose 0,2 M para obter uma suspensão de células densas.
4. Transfira 1 μL da solução contendo células coradas para um vidro de lâmina, coloque uma lamínula e observe com um microscópio de fluorescência equipado com um filtro ultravioleta (UV) usando uma lente objetiva com ampliação de 100X e óleo de imersão.
5. Confirme se a compactação do DNA é observada neste ponto na maioria das células.

Materiais