Síntese de antígenos proteicos de membrana estabilizados por nanodisco usando um sistema livre de células

Resumo

Fonte: Gilmore, S. F., et al. Produção em escala livre de células e adição de adjuvante a uma proteína principal recombinante da membrana externa de Chlamydia muridarum para o desenvolvimento de vacinas. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra a síntese livre de células de antígenos de proteínas de membrana estabilizados por nanodiscos usando um sistema de compartimento duplo. O dispositivo mantém condições ideais para síntese eficiente de proteínas, dobramento adequado e integração estável em nanodiscos.

Protocolo

Produção livre de células de partículas principais de nanolipoproteína de telodendrímero de proteína de membrana externa (MOMP-tNLPs) para formulações de vacinas de subunidade

1. Prepare MOMP-tNLPs usando métodos sem células.
   1. Duas horas antes de iniciar a reação sem células, abra o kit de expressão de proteínas livres de células procarióticas e descongele um dos tampões de reconstituição. Depois de descongelado, adicione um comprimido de coquetel de inibidor de protease livre de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e deixe dissolver completamente.

2. Siga este protocolo usando um kit projetado para executar reações de 5 x 1 mL.

   NOTA: Uma produção típica de aumento de escala é de 3 x 1 mL.

   1. Para cada reação de 1 mL, adicione 525 μL de tampão de reconstituição ao frasco de lisado de E. coli e role suavemente para dissolver. Adicione 250 μL de tampão de reconstituição ao frasco contendo aditivos de reação (por exemplo,., trifosfato de adenosina, trifosfato de guanosina) e enrole suavemente para dissolver.
   2. Adicione 8,1 ml de tampão de reconstituição ao frasco de alimentação de reação, tampe com uma rolha de borracha (tenha cuidado para não tocar no interior da rolha de borracha) e inverta/enrole suavemente para dissolver.
   3. Adicione 3 mL de tampão de reconstituição ao frasco da mistura de aminoácidos, tampe com uma rolha de borracha e inverta/enrole suavemente para dissolver.
      NOTA: Tome cuidado para não tocar no interior da rolha de borracha, pois isso pode causar contaminação.
   4. Adicione 1,8 ml de tampão de reconstituição ao frasco de metionina, enrole suavemente para dissolver e guarde no gelo até à utilização.
       
3. Preparar a solução de reacção.
   1. Ao frasco de lisado de E. coli , adicione 225 μL de Reaction Mix reconstituído, 270 μL de mistura de aminoácidos reconstituídos sem metionina e 30 μL de metionina reconstituída. Além disso, adicione 400 μL da mistura de 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC)/telodendrímero, 15 μg de plasmídeo MOMP e 0,6 μg de plasmídeo Δ49ApolipoproteinA1. Enrole / agite suavemente para misturar.
      NOTA: Certifique-se de que ambos os plasmídeos sejam construídos a partir do mesmo esqueleto de plasmídeo. Não vórtice.
   2. Pegue 20 μL da solução total e reserve-os em um tubo de 1,5 mL para a reação de controle que expressa a proteína fluorescente verde (GFP) (veja abaixo).
       
4. Prepare a solução de alimentação. Ao frasco da mistura de ração, adicione 2,65 mL de mistura de aminoácidos reconstituídos sem metionina e 300 μL de metionina reconstituída. Rolar/agitar suavemente para dissolver.
   NOTA: Neste momento, o tampão de reconstituição não utilizado e a metionina podem ser devolvidos ao freezer para armazenamento.
    
5. Transfira 1 mL da solução de reação para a câmara de reação interna fornecida no kit de reação livre de células e sele quando estiver cheio. Transfira 10 mL da solução de alimentação para a câmara externa do recipiente de reação e sele.
   NOTA: Não encha demais as câmaras! A presença de bolhas de ar na parte superior da câmara de reação interna e da câmara de alimentação interna afetará adversamente a reação. Qualquer solução de reação restante pode ser colocada em um tubo de 1,5 mL e misturada ao longo do recipiente principal.
    
6. Adicione 0,5 μL do plasmídeo de controle GFP (0,5 mg / mL) à mistura de reação de 20 μL previamente alíquota.
   NOTA: Muitos kits são fornecidos com um plasmídeo de controle para fins de controle de qualidade. A maioria dos plasmídeos que expressam GFP com um promotor T7 e um sítio de ligação ao ribossomo de E.coli (RBS) também pode ser usada como plasmídeo de controle.
    
7. Colocar a reação num agitador a 300 rpm, 30 °C até 18 h. Para verificar se a reação foi bem-sucedida, use uma fonte de luz UV para verificar a fluorescência devido à síntese da GFP de controle (Figura 1) após apenas 15 minutos de incubação.
   NOTA: Essas condições, particularmente a temperatura, podem precisar ser otimizadas para a expressão de outras proteínas de membrana.

Resultados

Figura 1: Expressão e purificação de MOMP-tNLP. (A) Imagem de tubos contendo pequenas alíquotas de uma reação livre de células que expressou com sucesso os controles de GFP luminando sob fonte de luz UV (direita) em ...

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