Western Blot para avaliar a integridade estrutural de um antígeno de vacina bacteriana

Resumo

Fonte: Gilmore, S. F. et al. Produção em escala livre de células e adição de adjuvante a uma proteína principal recombinante da membrana externa de Chlamydia muridarum para o desenvolvimento de vacinas. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra o uso de Western blotting para avaliar a integridade estrutural da principal proteína da membrana externa (MOMP) dentro de complexos de vacinas baseados em nanopartículas. Ele descreve as principais etapas envolvidas na transferência de proteínas, marcação de anticorpos e imagens de fluorescência.

Protocolo

1. Western blot

1. Para western blotting, resolva a principal proteína da membrana externa (MOMP) - partículas de nanolipoproteína de telodendrímero (tNLPs) por SDS-PAGE e transfira os géis usando um sistema comercial de dry blotting com configurações padrão de acordo com o protocolo do fabricante.
   1. Remova os borrões da pilha após a conclusão da transferência e incube cada borrão durante a noite a 4 ° C em um tampão de bloqueio adequado contendo 0,2% de Tween 20 e 0,5 mg / mL de anticorpo monoclonal (MAb) 40 ou 0,2 mg / mL de anticorpo anti-His-tag MAbHIS dirigido contra o His-tag da proteína Δ49ApoA1.
      NOTA: As diluições de anticorpos usadas para blotting são 1:1.000 para MAb40 e 1:500–1.000 para anticorpos MAbHIS.
   2. Lave cada borrão 3 vezes por 5 min com PBS-T (1x solução salina tamponada com fosfato (PBS), 0,2% Tween 20, pH 7,4).
   3. Incube os borrões por 1 h em tampão de bloqueio contendo anticorpo secundário conjugado a um fluoróforo (por exemplo, corante infravermelho (IRDye)) em uma diluição de 1:10.000.
   4. Lave novamente os borrões 3 vezes por 5 min com PBS-T. Use um gerador de imagens de fluorescência para obter imagens das manchas após a lavagem final.

Materiais