Preparação e transformação de bactérias usando eletroporação de alta tensão

Resumo

Fonte: Stefan, A., et al., Os benefícios multifacetados da co-expressão de proteínas em Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra o procedimento para transformar Escherichia coli com um plasmídeo portador de um gene de resistência a antibióticos, incluindo preparação celular, eletroporação, recuperação e seleção de transformantes.

Protocolo

1. Isolamento de Co-transformantes de E. coli

1. Preparar células eletrocompetentes da estirpe de E. coli apropriada a transformar. Transferir para 1 ml de meio Luria-Bertani (LB) (triptona, extracto de levedura, NaCl a 10, 5 e 10 g/L, respectivamente) uma única colónia da estirpe escolhida e incubar a 37 °C em condições de agitação de 180 rpm. Diluir a pré-cultura 1:500 em 25 ml de meio LB fresco e incubar a cultura a 37 °C.
2. Na fase logarítmica (0,6 O.D. ou densidade óptica), centrifugue a suspensão celular a 5.000 x g por 20 min e ressuspenda o pellet em 10%, v / v glicerol estéril gelado na metade do volume de cultura original. Repita esta etapa 4 vezes, reduzindo pela metade o volume de ressuspensão. Finalmente, ressuspenda o pellet em glicerol/água e divida a suspensão celular em alíquotas de 50 μl. Conservar as alíquotas a -80 °C até 6 meses.
3. Dissolva o plasmídeo desejado em água estéril suplementada com EDTA 0,5 mM (ácido etilenodiaminotetracético). Descongelar uma alíquota de células eletrocompetentes no gelo e misturar com uma quantidade adequada (2,5-5 ng) de vector. Dispensar a mistura para uma cubeta de 0,1 cm adequada para eletroporação e aplicar 1,8 kV.
4. Transfira imediatamente as células eletroporadas para 1 ml de meio SOC (caldo super ótimo com repressão catabólica) (meio LB suplementado com 0,2% p / v de glicose, 10 mM MgCl₂, 2,5 mM KCl), incube por 1 hora sob agitação e, finalmente, transfira alíquotas de 100 μl para placas de Petri contendo ágar LB com o antibiótico apropriado. Incubar O/N a 37 °C.
5. Purifique os transformantes listrando colônias únicas em placas de Petri.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ágar	Sigma-Aldrich	Resposta A1296
Ampicilina	Sigma-Aldrich	A9518
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Kcl	Sigma-Aldrich	Pág. 9541
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
Triptona	Sigma-Aldrich	95039
Extrato de levedura	Fluka	70161
Cuvetes 0,1 cm	BioRad	1652089	Para eletroporação
Centrífuga 5415R	Eppendorf
Centrífuga Allegra 21R	Beckman
Eletroporação do Gene Pulser II	BioRad