Avaliando a frequência de mutação em bactérias usando o ensaio de beta-glicosidase

Abstract

Fonte: Stefan, A., et al. Os benefícios multifacetados da co-expressão de proteínas em Escherichia coli. J. Vis. Exp. (96), (2015).

Este vídeo demonstra a avaliação da frequência de mutação em bactérias usando um ensaio de beta-glicosidase. Culturas bacterianas que expressam uma DNA polimerase deficiente em revisão são coletadas ao longo de gerações sucessivas. Erros de replicação causados pela revisão reduzida podem ativar um gene da beta-glicosidase suprimido. Após centrifugação e permeabilização, um substrato é adicionado e a atividade enzimática é medida para quantificar a frequência de mutação nas amostras.

Protocol

1. Isolamento de Escherichia coli ou Co-transformantes de E. coli

1. Preparar células eletrocompetentes da estirpe de E. coli apropriada a transformar. Transferir para 1 ml de meio Luria-Bertani (LB) (triptona, extracto de levedura, cloreto de sódio ou NaCl a 10, 5 e 10 g/L, respectivamente) uma única colónia da estirpe escolhida e incubar a 37 °C em condições de agitação de 180 rpm. Diluir a pré-cultura 1:500 em 25 ml de meio LB fresco e incubar a cultura a 37 °C.
2. Na fase logarítmica (0,6 O.D.), centrifugue a suspensão celular a 5.000 x g por 20 min e ressuspenda o pellet em 10%, v / v gelada de glicerol estéril na metade do volume de cultura original. Repita esta etapa 4 vezes, reduzindo pela metade o volume de ressuspensão a cada vez. Finalmente, ressuspenda o pellet em glicerol/água e divida a suspensão celular em alíquotas de 50 μl. Conservar as alíquotas a -80 °C até 6 meses.
3. Dissolva o plasmídeo desejado em água estéril suplementada com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 mM. Descongele no gelo uma alíquota de células eletrocompetentes e misture com uma quantidade adequada (2,5-5 ng) de vetor. Dispensar a mistura para uma cubeta de 0,1 cm adequada para eletroporação e aplicar 1,8 kV.
4. Transfira imediatamente as células eletroporadas para 1 ml de caldo super ideal com meio de repressão catabólica (SOC) (meio LB suplementado com 0,2% p / v de glicose, cloreto de magnésio 10 mM ou MgCl₂, cloreto de potássio 2,5 mM ou KCl), incube por 1 hora sob agitação e, finalmente, transfira alíquotas de 100 μl para placas de Petri contendo ágar LB com o antibiótico apropriado. Incubar durante a noite (O/N) a 37 °C.
5. Purifique os transformantes listrando colônias únicas em placas de Petri.
6. Prepare as células eletrocompetentes dos transformantes primários e repita as etapas 1.1 a 1.5 para transformar com outros plasmídeos.
7. Preparar as reservas de glicerol dos co-transformadores. Transfira uma única colônia em LB suplementada com os antibióticos apropriados, incube a 37 ° C sob agitação e na fase logarítmica (0,6 O.D.), centrifugue a suspensão celular a 5.000 x g por 20 min. Ressuspenda o pellet em meio antibiótico LB contendo 15% v / v de glicerol. Distribuir em alíquotas e conservar a – 80 °C.

2. Análise de mutação de populações que co-expressam a subunidade ε do tipo selvagem da DNA polimerase III de E. coli e a variante mutagênica εD12A

1. Transferir uma única colónia de E. coli TOP10 contendo os vectores pBAD-ε e pGOOD1-εD12A para 1 ml de meio LB-antibióticos. Incubar O/N a 37 °C.
2. Diluir a pré-cultura 1:250 em 3 frascos contendo meio fresco (10 ml), adicionar os indutores apropriados [arabinose, isopropil β-d-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) ou arabinose e IPTG, 1 mM cada] e incubar a 37 °C durante 8 horas. Preparar em paralelo culturas não induzidas.
3. Recolher alíquotas de 1 ml e diluir 1/500 em balões novos contendo meio fresco (10 ml) completado ou não com os indutores adequados. Incubar O/N a 37 °C.
4. Repetir os passos 2.2 e 2.3 e recolher alíquotas de 1 ml.
5. Determine o número de gerações que ocorreram em cada cultura. Transferir em placas LB, 100 μl de diluições seriadas adequadas de inóculo e cultura. Incubar O/N a 37 °C. Contar as colónias nas placas LB e calcular o log do número de células presentes no inóculo (log_I) e na cultura no final do crescimento (log_C). Para determinar o número de gerações, use a fórmula: (log_C– log_I)/0,301.
6. Centrifugue a 5.000 x g por 20 min e ressuspenda as células em 1 ml de cloridrato de tris (hidroximetil) aminometano (Tris-HCl) 50 mM, pH 7,6, NaCl 50 mM. Para permeabilizar as células, adicione 2-3 gotas de clorofórmio e vórtice por 20 segundos.
7. Determinar a atividade da β-glucosidase de cada alíquota numa microplaca de 96 poços, utilizando como substrato p-nitrofenil-β-D-glucopiranosídeo (PNPGluc). Adicionar a cada poço 100 μl de células permeabilizadas e 100 μl de substrato (16 mg/ml de solução-mãe em água ou H₂O). Tome cuidado para evitar bolhas de ar nos poços. Ler a Absorbância a 420 nm, utilizando um leitor de microplacas e o filtro adequado.

Materials