Extração e Purificação de Plastoglóbulos de Bactérias Fotossintéticas

Resumo

Fonte: Shivaiah, K., et al. Isolamento de gotículas lipídicas de plastoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias. J. Vis. Exp. (2022)

O vídeo demonstra o isolamento de plastoglóbulos de cianobactérias. Começa com uma cultura de cianobactérias e prossegue através da ruptura celular usando força mecânica. A liberação de pigmentos fotossintéticos indica lise bem-sucedida. Um gradiente de etapa de sacarose é então usado para separar os componentes celulares por densidade, permitindo que plastoglobulinos de baixa densidade formem uma banda distinta no topo. Esta fração é coletada e preservada para análise posterior.

Protocolo

1. Isolamento de plastoglobulinos brutos

1. Extração bruta de plastoglobulinos de cianobactérias
   1. Cultive uma cultura de 50 mL de Synechocystis sp. PCC 6803 até a fase estacionária (cerca de 7-10 dias) e ajuste a densidade celular para uma densidade óptica a 750 nm (OD₇₅₀) de 2,0 usando um espectrofotômetro. Para condições de cultura, use meio BG-11 e cresça em uma incubadora a uma intensidade de luz de 150 μmol fótons/m²/s, 2% CO₂, 32 °C e com agitação contínua a 150 rotações por minuto (rpm).
   2. Para remover os polissacarídeos, lave as células centrifugando a cultura de 50 mL a 6.000 × g por 45 min a 4 ° C e, em seguida, removendo o sobrenadante. Continue lavando as células duas vezes em 50 mL de tampão A (Tabela 1). Retirar uma alíquota do homogeneizado de células e retirá-la antes da centrifugação para ser armazenada como uma amostra total representativa da célula
   3. Ressuspenda o pellet lavado em 25 mL de tampão A e quebre as células usando uma célula de pressão francesa a 1.100 libras por polegada quadrada (psi), repetindo o processo 3× (coloque a amostra no gelo entre cada ciclo para evitar a desnaturação da proteína) até que a cor lisada mude de verde para vermelho-azul-verde sob luz branca. Use uma célula pré-resfriada e execute esta etapa na câmara fria.
   4. Distribua o homogeneizado resultante entre oito tubos de ultracentrífuga de 3 mL cheios até um máximo de 2,5 mL em cada tubo e, em seguida, cubra cuidadosamente com 400 μL de meio R, produzindo um gradiente de degrau.
   5. Equilibre cuidadosamente os tubos adicionando meio R adicional, conforme necessário, e centrifugue por 30 min a 150.000 × g a 4 °C. O tilacóide e outras organelas mais pesadas (incluindo quaisquer corpos de polihidroxialcanoato) serão pellets, enquanto os plastoglóbulos serão prontamente vistos como uma almofada amarela e oleosa no topo ou próximo ao topo do gradiente de sacarose (Figura 1C).
   6. Colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos brutos com uma seringa e agulha 22G e deposite em um tubo de 2 mL. Raspe os plastoglóbulos da lateral da parede do tubo de ultracentrífuga com a ponta da agulha, se necessário.
   7. Continue para a etapa 2.2. Em alternativa, armazenar plastoglóbulos brutos a -80 °C e purificar mais tarde.

Tabela 1: Receitas tampão para isolamento de plastoglobulos do tecido foliar da planta ou cianobactérias.

Composições de buffer a
Amortecedor de moagem	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM Cloreto de magnésio (MgCl2)
	100 mM de sorbitol
	5 mM de ácido ascórbico b
	5 mM de cisteína b reduzida
	0,05 % (p/v) de albumina de soro bovino (BSA) b
Médio R	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
Médio R 0,2	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
	0,2 M de sacarose
Médio R 0,7	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
	0,7 M sacarose
Buffer A	25 mM HEPES-KOH (pH 7,8)
	250 mM de sacarose
um. As concentrações finais de cada componente do tampão são fornecidas.
b. Deve ser adicionado fresco no dia do isolamento. Embora os tampões possam ser preparados no dia anterior ao isolamento, certos ingredientes devem ser adicionados frescos no dia do isolamento, bem como quaisquer inibidores de fosfatase e protease.

2. Colheita de plastoglóbulos puros

1. Processamento de cianobactérias
   1. Produza um gradiente de sacarose em quatro tubos de ultracentrífuga de 2,5 mL, em camadas primeiro com 500 μL dos plastoglóbulos brutos da etapa 1.3 misturados com 750 μL de meio R 0,7 e, em seguida, sobrepondo com 750 μL de meio R 0,2.
   2. Centrifugar o gradiente de sacarose a 150.000 × g durante 90 min a 4 °C. Recolher os plastoglóbulos puros (figura 1C) com uma seringa e uma agulha de 22 G da fase superior do gradiente de sacarose e transferir para um tubo de 1,5 ml.
   3. Alíquota dos plastoglóbulos puros e congelamento rápido em nitrogênio líquido. Armazene diretamente a -80 °C ou liofilize até obter um pó seco.

Resultados

Figura 1: Isolamento e immunoblotting de plastoglobulos e tilacóides. (A) Uma amostra representativa de plastoglobulinos purificados de Z. mays antes da extração do gradiente de sacarose. (B) Uma amos...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ascorbato	BDH	BDH9242
Albumina de soro bovino	Proliant Biológico	68700
Célula de pressão francesa (modelo FA-079)	SLM/Aminco	N/A
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Cloreto de magnésio	Sigma Aldrich	M8266
Incubadora de agitação Multitron	Jogadores de Inteligência HT	N/A
Hidróxido de potássio	Produtos Químicos Fisher	M16050
Cisteína reduzida	Bioquímicos MP	101444
Sorbitol	Sigma Aldrich	S3889
Sacarose	Sigma Aldrich	S9378
Synechocystis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Ultracentrífuga Optima MAX-TL	Beckman Coulter	A95761