Purificação por gradiente de densidade de plastoglóbulos de cianobactérias

Resumo

Fonte: Shivaiah, K., et al. Isolamento de gotículas lipídicas de plastoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demonstra o isolamento de plastoglóbulos de cianobactérias usando centrifugação com gradiente de densidade de sacarose, destacando sua natureza rica em lipídios e de baixa densidade e garantindo sua preservação estrutural para análise a jusante.

Protocolo

1. Colheita de plastoglóbulos puros

1. Processamento de cianobactérias
   1. Produza um gradiente de sacarose em quatro tubos de ultracentrífuga de 2,5 mL em camadas primeiro com 500 μL dos plastoglóbulos brutos da etapa 1.3 misturados com 750 μL de meio R 0,7 e, em seguida, sobreponham com 750 μL de meio R 0,2 (Tabela 1)
   2. Centrifugue o gradiente de sacarose a 150.000 x g por 90 min a 4 ° C. Colete os plastoglóbulos puros (Figura 1C) com uma seringa e agulha de 22 G da fase superior do gradiente de sacarose e transfira para um tubo de 1,5 mL.
   3. Alíquota dos plastoglóbulos puros e congelamento rápido em nitrogênio líquido. Armazene diretamente a -80 °C ou liofilize até obter um pó seco.

Tabela 1: Receitas tampão para isolamento de plastoglobulos de cianobactérias.

Médio R	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
Médio R 0,2	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
	0,2 M de sacarose
Médio R 0,7	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl2
	0,7 M sacarose

Resultados

Figura 1: Isolamento e immunoblotting de plastoglobulos e tilacóides. (A) Uma amostra representativa de plastoglobulinos purificados de Z. mays antes da extração do gradiente de sacarose. (B) Uma amos...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Cloreto de magnésio	Sigma Aldrich	M8266
Sacarose	Sigma Aldrich	S9378
Synechocystis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Ultracentrífuga Optima MAX-TL	Beckman Coulter	A95761