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1. Alimentando vermes em bactérias vivas em cultura líquida
NOTA: Este protocolo é usado para colonizar vermes com bactérias cultivadas em laboratório em condições bem misturadas em cultura líquida. Os vermes podem ser colonizados com isolados individuais de cultura pura (por exemplo, patógenos como Enterococcus faecium) ou misturas de isolados (por exemplo, comunidades mínimas de microbioma).
- Comece com vermes adultos sincronizados lavados com sacarose em um tubo cônico de 15 mL. Lave os vermes uma vez em 12 mL de tampão S e descarte o sobrenadante.
- Ressuspenda os vermes lavados no volume de meio S necessário para o experimento. Considere o volume de condições experimentais, o número de condições sobre as quais os vermes serão divididos e as concentrações finais de vermes e bactérias.
NOTA: A alimentação de vermes varia de acordo com a disponibilidade bacteriana e os vermes podem ser estressados pela aglomeração. Para colonização em cultura líquida, recomenda-se <1000 vermes/mL e >107 UFC/mL; 1011 UFC/mL é considerada densidade alimentar "ad libitum" em E. coli. - Gire as culturas bacterianas. Despeje o sobrenadante; Aspiração ou pipetagem podem ser usadas para remover o sobrenadante de bactérias que formam pastilhas soltas.
NOTA: Para culturas >5 mL, transfira para tubos de 15 mL e gire a ~ 2800 x g em uma grande centrífuga de mesa por 8-10 min. As culturas <5 mL podem ser transferidas para tubos de 1,5 mL e centrifugadas a 9000 x g por 1-2 min em uma pequena centrífuga de mesa. Bactérias altamente móveis (por exemplo, muitas espécies de Pseudomonas) podem precisar ser resfriadas a 4 °C por 10-15 min para facilitar a formação de um pellet estável, e pode ser melhor centrifugar a 4 °C. - Ressuspenda as culturas bacterianas em um volume de tampão S e centrifugue novamente para o pellet. Remover e rejeitar o sobrenadante como antes.
- Ressuspender as culturas bacterianas em meio S na densidade desejada para o experimento, além de quaisquer antibióticos para seleção. Os antibióticos a serem usados, se houver, dependerão do perfil de resistência das bactérias usadas para colonização.
- Usando uma ponta de pipeta revestida com tampão de sem-fim M9 suplementado com 0,01% de Triton X-100 (M9TX-01), pipete os vermes suavemente para cima e para baixo até que os vermes sejam completamente ressuspensos em meio S e, em seguida, transfira para tubos ou poços de placa para colonização bacteriana.
- Adicione suspensão bacteriana a cada cultura de vermes para atingir a concentração bacteriana desejada e o volume final.
- Se estiver usando uma placa de vários poços para colonização, cubra a placa com uma membrana de vedação estéril permeável a gás de 96 poços.
- Incubar com agitação a 200 RPM para evitar que as bactérias se instalem durante a incubação.
2. Ruptura mecânica de sem-fins individuais em um formato de 96 poços
NOTA: Esta seção descreve um protocolo de formato de placa de 96 poços para interrupção mecânica de C. elegans individuais colonizados por bactérias. As primeiras etapas do protocolo descrevem um método para eliminar bactérias não aderidas do intestino do verme e limpar o exterior dos vermes usando paralisia a frio e branqueamento de superfície. Essas etapas produzirão vermes adultos vivos e limpos que podem ser mecanicamente interrompidos para quantificação do conteúdo bacteriano ou usados para experimentos adicionais. Este protocolo pode ser adaptado para quantificar bactérias em vermes colonizados em cultura líquida, em placas de ágar ou de solo natural ou microcosmo.
- Coloque uma alíquota de M9TX-01 no gelo para esfriar (4-5x o número de amostras em mL).
- Prepare uma alíquota de M9TX-01 + alvejante (hipoclorito de sódio a 6%, 1:1000 ou 1:2000 v/v, 1 mL por amostra + 1 mL extra) e coloque sobre gelo para esfriar.
- Ressuspenda cada amostra de verme em 1 mL de M9TX-01 em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Gire os tubos brevemente (2-3 s) em uma minicentrífuga de baixa velocidade (2.000 x g) a 25 ° C para pellets adultos. Pipetar o sobrenadante e descartar, certificando-se de não perturbar o pellet de minhoca.
- Usando centrifugação, enxágue os vermes duas vezes com 1 mL de M9TX-01 e, em seguida, uma vez com 1 mL de tampão de verme M9, para reduzir as bactérias externas.
- Purgue as bactérias não aderidas do intestino do verme.
- Ressuspenda cada amostra de vermes em 1 mL de meio S + 2x OP50 morto pelo calor em um tubo de cultura.
- Incubar a 25 °C durante 20-30 min para permitir a passagem de quaisquer bactérias não aderentes do intestino.
NOTA: Isso também eliminará qualquer proteína fluorescente extracelular do lúmen e permitirá uma visualização mais clara das bactérias marcadas aderidas ao epitélio intestinal, particularmente quando fluoróforos álcool-ácido resistentes (por exemplo, mCherry, dsRed) são usados.
- Superfície de vermes de branqueamento para limpar bactérias externas.
- Enxágue os vermes purgados duas vezes com 1 mL de M9TX-01 frio e descarte o sobrenadante.
- Deixe os tubos esfriarem por 10 min no gelo (de preferência) ou a 4 °C. Isso paralisará os vermes e evitará a ingestão de alvejante.
NOTA: Outros protocolos usam um agente de paralisia química, como o levamisol; Esta é uma abordagem estabelecida que requer a adição de um fluxo de resíduos perigosos. - Adicione 1 mL de tampão minhoca M9 gelado + alvejante sem perfume (hidróxido de sódio a 8,25%, 1:1000 ou 1:2000 v/v) a cada tubo. Deixe os tubos assentarem no gelo (de preferência) ou a 4 °C durante pelo menos 10 minutos para matar as bactérias externas.
NOTA: Não exceda a concentração de 1:1000 de alvejante. Mesmo em vermes paralisados, pode ocorrer mortalidade. - Pipete o tampão de lixívia e descarte; Retorne os tubos ao gelo para garantir que os vermes não retomem o bombeamento até que o alvejante seja removido.
- Adicione 1 mL de M9TX-01 frio a cada tubo. Gire por ~5 s em uma minicentrífuga (2.000 x g a 25 °C); retorne os tubos ao gelo. Remova o sobrenadante e descarte.
- Repita esta etapa de enxágue com mais 1 mL de M9TX-01 frio, descartando o máximo possível do sobrenadante.