Interrupção mecânica de vermes individuais para avaliar a variabilidade nas interações hospedeiro-bactéria

Resumo

Fonte: Taylor, M. N. et al. Usando dados de verme único para quantificar a heterogeneidade nas interações Caenorhabditis elegans-bacterianas. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra a quantificação da variabilidade da carga bacteriana intestinal em Caenorhabditis elegans individuais por meio de interrupção mecânica. Ele descreve as etapas para preparação de amostras, interrupção mecânica, diluição em série e contagem de colônias para avaliar as diferenças na carga bacteriana intestinal entre vermes individuais.

Protocolo

1. Separe os sem-fins em uma placa profunda de 96 poços com grão de carboneto de silício para interrupção mecânica. Prepare a placa de ruptura de 96 poços da seguinte maneira.
   1. Obtenha uma placa estéril de 2 mL de 96 poços de profundidade e uma tampa de placa de silicone de 96 poços correspondente.
      NOTA: É importante usar placas compatíveis com os adaptadores de 96 poços para o disruptor tecidual. Pequenas diferenças nas dimensões externas fazem a diferença entre uma placa que pode ser removida dos adaptadores e outra que não pode.
   2. Usando uma espátula estéril, adicione uma pequena quantidade de carboneto de silício estéril de grão 36 a cada poço da placa que receberá um verme. Use areia suficiente para cobrir mal o fundo do poço (cerca de 0,2 g por poço). O excesso de material dificultará a colocação de uma ponta de pipeta no fundo do poço ao recuperar o conteúdo.
   3. Adicione 180 μL de tampão sem-fim M9 a cada poço.
   4. Rotule as colunas ou linhas para indicar para onde cada amostra irá e, em seguida, cubra a placa frouxamente com a tampa da placa de silicone de 96 poços.
2. Transfira vermes individuais para a placa de 96 poços para interrupção.
   1. Mova os vermes permeabilizados com cuidado para uma placa de Petri pequena (35 ou 60 mm) contendo tampão de verme M9 suficiente suplementado com 0,01% de Triton X-100 (M9TX-01) para encher o prato a uma profundidade de ~ 1 cm.
      NOTA: Se um grande número de vermes estiver presente, pode não ser viável transferir toda a amostra, pois o líquido ficará lotado e será difícil pipetar vermes individuais.
   2. Usando um microscópio de dissecação ou outro dispositivo de baixa ampliação, pipetar vermes individuais em volumes de 20 μL e transferir esses vermes para poços individuais da placa de 96 poços.
      NOTA: É melhor colher apenas vermes recém-mortos. Evite vermes com uma forma rígida e linear, pois esses vermes podem estar mortos há algum tempo. Tente pegar vermes curvos ou em forma de S, com fisiologia macroscópica normal e intestino intacto.
   3. Depois de transferir cada volume, certifique-se de que o verme selecionado foi realmente ejetado para o poço. Para fazer isso, pipete 20 μL de M9TX-01 de uma área livre da placa de Petri e libere todo o volume de volta para a placa; Isso normalmente ejetará o verme se ele estiver preso à pipeta. Se o verme ficou preso, remova 20 μL do poço e tente a transferência novamente.
   4. Depois que todos os vermes forem transferidos, cubra a placa de 96 poços com uma folha de filme de vedação flexível com papel disponível comercialmente (2 x 2 quadrados), certificando-se de que o lado com papel do filme de vedação esteja voltado para baixo nos poços de amostra. Tenha cuidado para não esticar muito o filme de vedação, ou será muito difícil removê-lo mais tarde.
   5. Coloque a esteira de vedação de silicone levemente em cima do filme de vedação flexível; Não pressione a tampa para baixo nos poços neste momento.
   6. Mova a placa para 4 °C para esfriar por 30-60 min. Isso evitará o superaquecimento durante a interrupção, o que pode danificar as amostras.
      NOTA: Este é um ponto de interrupção no protocolo. Na maioria dos casos, a placa pode ser deixada a 4°C por até 4 h antes da moagem. Não deixe os vermes durante a noite, pois isso alterará a contagem bacteriana.
3. Carregue placas de 96 poços em um disruptor de tecido para quebrar os tecidos do verme e liberar bactérias intestinais.
   NOTA: (Opcional) Se estiver usando um número ímpar de placas de 96 poços para digestões, é necessário preparar um contrapeso antes de prosseguir. Use uma placa vazia de 96 poços e encha os poços com água até que pese o mesmo que a primeira placa.
   1. Pressione a esteira de vedação de silicone firmemente nos poços para criar uma vedação, certificando-se de que a tampa fique plana em toda a superfície da placa.
      NOTA: Se o filme de vedação flexível for muito espesso após o alongamento, será difícil prender a tampa de silicone de forma que ela fique plana em todos os poços. Isso resultará em uma vedação insuficiente e contaminação poço a poço durante a agitação.
   2. Prenda as placas no disruptor de tecido usando os adaptadores de placa de 96 poços. Agite as placas por 1 min a 30 Hz, depois gire as placas 180° e agite novamente por 1 min. Isso ajudará a garantir uma interrupção uniforme em todos os poços da placa.
   3. Bata as placas firmemente na bancada duas ou três vezes para desalojar qualquer areia do filme de vedação flexível.
   4. Usando uma centrífuga grande com dois adaptadores de placa de 96 poços, gire as placas a 2400 x g por 2 min para reunir todo o material no fundo dos poços.
   5. Remova a tampa de silicone e retire cuidadosamente o filme de vedação flexível.
      NOTA: Se a película de vedação flexível grudar em qualquer um dos poços, use uma ponta de pipeta de 200 μL para removê-la. Isso é comum quando o filme de vedação flexível é esticado muito fino.
4. Amostras de digestão de vermes diluídas em série em 300 μL em placas de 96 poços.
   1. Usando um pipetador de vários poços ajustado para 200 μL, pipete para cima e para baixo várias vezes lenta e cuidadosamente para remisturar o conteúdo dos poços e, em seguida, retire o máximo possível do líquido. Transfira este líquido para as fileiras superiores das placas de 96 poços preparadas para diluição em série de amostras de vermes interrompidas.
   2. Usando um pipetador de 96 poços ajustado para 20 μL, remova esse volume de líquido da linha superior e distribua na linha B. Pipete para cima e para baixo 8-10x para misturar. Descarte as pontas.
   3. Repita a etapa 4.2, começando pelas amostras 0,1x na linha B para criar amostras de diluição 0,01x na linha C.
   4. Repita a etapa 4.2 novamente, indo da linha C para a linha D.
   5. Placa em ágar sólido para quantificação bacteriana. Para vermes monocolonizados, geralmente é suficiente plaquear gotas de 10-20 μL de cada diluição [1x-0,001x] em placas de ágar. Para a colonização multiespécie, aplicar separadamente cada diluição em uma placa de 100 μL para uma placa de ágar de 10 cm; Espalhe imediatamente usando contas de vidro.

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