Quantificando a polaridade e a dinâmica de um componente do sistema de secreção em Legionella pneumophila

Abstract

Fonte: Chetrit, D., et al. Aplicação de imagens de células vivas e tomografia crioeletrônica para resolver características espaço-temporais do sistema de secreção de pontos/ICM de Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra o uso de imagens de fluorescência de células vivas para quantificar a polaridade e a dinâmica dos componentes do sistema de secreção em Legionella pneumophila, permitindo a análise do recrutamento espacial e da redistribuição citosólica crítica para a compreensão da patogênese bacteriana

Protocol

1. Quantificação da localização polar e dinâmica de componentes Dot/ICM

NOTA: As etapas a seguir são projetadas para imagens com 0,129 μm por pixel que foram adquiridas com binning 2 x 2.

1. Quantificação da polaridade para proteínas de fusão sfGFP (superpasta green fluorescent protein) (Figura 1)
   1. Ajuste o contraste da imagem para que as bactérias fiquem claramente visíveis. Use a ferramenta de região para colocar um retângulo de 0,25 x 1,3 μm² começando no pólo e estendendo-se até o citoplasma. O retângulo deve permanecer precisamente dentro das bordas bacterianas.
   2. Marque pelo menos 200 bactérias e use o botão Região para mascarar para criar máscaras para as regiões de interesse. Em Estatísticas de máscara e Escopo da máscara, escolha Objeto. Em seguida, em Recursos e Intensidade, marque Intensidade Média e Variância.
   3. Exporte os dados e calcule os escores de polaridade de cada bactéria como a razão entre a variância e a intensidade média.
   4. Para aplicações de alto rendimento, use uma objetiva de fase e uma configuração de condensador apropriada para adquirir imagens com os canais de fase e 488 nm. Certifique-se de escolher campos de visão onde as bactérias estão totalmente separadas.
   5. Ajuste o contraste do canal de fase da imagem para um nível em que as bactérias sejam claramente visíveis. Abra a imagem de canal duplo, inicie a janela Criar máscara de segmento e altere o canal para fase.
   6. Ajuste um limite apropriado e remova objetos pequenos com o botão Definir objetos . Em Refinar máscara, escolha Remover objetos de bordas e, posteriormente, separe as máscaras de bactérias adjacentes umas às outras.
   7. Calcule as pontuações de polaridade do sinal no canal 488 para cada célula, conforme descrito anteriormente nas etapas 1.1.2 a 1.1.3.
2. Quantificação da dinâmica para proteínas de fusão sfGFP (Figura 2)
   NOTA: A dinâmica é definida como mudanças na intensidade ao longo do tempo, e as etapas a seguir são projetadas para curtos períodos de imagem (ou seja, vários minutos). Adicione à almofada os suplementos apropriados se desejar períodos de imagem mais longos.
   1. Na janela Image Capture , marque Timelapse, insira o tempo dos intervalos na caixa de intervalo e insira 2 na caixa # de Pontos de Tempo . Adquira duas imagens sucessivas de Legionella pneumophila expressando a proteína fluorescente de interesse.
   2. Ajuste o contraste da imagem até que as células fiquem claramente visíveis. Siga a Figura 2A e as descrições abaixo para colocar três máscaras diferentes. Use a ferramenta de região para colocar um quadrado de 0,25 x 0,25 μm no meio de pelo menos 400 células.
   3. Use o botão Região para mascarar para criar uma máscara (máscara 1) dos quadrados de interesse. Crie uma nova máscara vazia (máscara 2) e use a ferramenta pixel ou a ferramenta polígono para marcar toda a área da célula de pelo menos 25 células aleatórias, que serão usadas para calcular o branqueamento de fluorescência. Crie uma nova máscara vazia (máscara 3) e use a ferramenta pincel grande para marcar áreas entre as células, que serão usadas para subtração de fundo.
   4. Em Estatísticas de máscara e Escopo da máscara, escolha Objeto para máscara 1 e máscara 2. Em seguida, em Recursos e intensidade, escolha Intensidade média e exporte os dados das duas máscaras. Para a máscara 3, exporte a intensidade média de toda a máscara.
   5. Calcule a mudança na intensidade de fluorescência para cada objeto na máscara 1 usando as seguintes fórmulas:

onde a máscara 1 é um quadrado de 0,25 μm × 0,25 μm colocado no centro da célula, a máscara 2 cobre toda a célula, a máscara 3 é o fundo entre as células, t1 é a intensidade média no primeiro ponto de tempo e t2 é a intensidade média no segundo ponto de tempo.

Results

Figura 1: Quantificação da localização polar das subunidades do sistema Dot/ICM. (A) A visualização em tempo real de DotB-sfGFP expressa em Lp01 mostrou localização polar. DotB-sfGFP exibiu um padrão difuso quando exp...

Materials