Preparação de Legionella pneumophila para Tomografia Eletrônica Criogênica

Resumo

Fonte: Chetrit, D., et al. Aplicação de imagens de células vivas e tomografia crioeletrônica para resolver características espaço-temporais do sistema de secreção de pontos/ICM de Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020)

O vídeo descreve como preparar amostras de Legionella pneumophila para tomografia crioeletrônica, combinando cultura bacteriana, marcação de nanopartículas de ouro e técnicas de vitrificação. O processo preserva as estruturas celulares nativas e permite imagens de alta resolução dos componentes do sistema de secreção associados à membrana.

Protocolo

1. Detecção de densidade de massa sfGFP com Cryo-ET

1. Preparação da amostra, coleta de dados e reconstrução

1. Cultive uma mancha pesada de Legionella pneumophila expressando uma proteína Dot / Icm marcada com fluorescência em placas CYE-ágar-estreptomicina por 48 horas a 37 ° C. Ressuspenda as células em ddH₂O a um OD₆₀₀ de 0,7. Adicione 5 μL de partículas de ouro coloidal (BSA Tracer, 10 nm) a 20 μL da suspensão celular.

2. Pipete 5 μL da mistura de células em uma grade de carbono furada recém-descarregada (R 2/1 em malha 200) e deixe descansar por 1 min. Seque com papel de filtro e congele em etano líquido usando um aparelho de êmbolo acionado por gravidade.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Partículas de ouro coloidal de 10 nm	Aurion	25486
100x Objetiva Plan Apo (1,4 NA)	Nikon
ASES	Sigma-Aldrich	A9758
Câmera digital monocromática CoolSNAP EZ 20 MHz	Fotometria
Estrutura Genética, 1,7x2,8 cm, 125 μL	Fisher Científico	AB-0578
Grelha de carbono Holey R 2/1 200 mesh	Quantifoil	Q225-CR1
Nitrato de ferro (III) nonahidratado	Sigma-Aldrich	216828
Câmera K2 Summit para crio-EM	GATAN
Lâminas de cobertura para microscópio 22x22 mm	Fisher Científico	12-542B
Lâminas de cobertura para microscópio 24x50 mm	Fisher Científico	12-545K
Lâminas de microscópio 25x75x1 mm	Globo Científico	1380
SlideBook 6.0	Inovações em imagens inteligentes
Motor leve Spectra X	Lumencor