Cultivando a bactéria de crescimento rápido Vibrio natriegens

Resumo

Fonte: Wiegand, D. J., Lee, et al., Expressão de proteínas livres de células usando a bactéria de crescimento rápido Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o cultivo e a colheita de Vibrio natriegens, uma bactéria de crescimento rápido, sob condições aeradas para preparar pellets bacterianos para a geração de extrato bruto.

Protocolo

Preparação de Extrato de Células Brutas Vibrio natriegens - Cultura Bacteriana

1. Prepare o meio de crescimento bacteriano de V. natriegens LB-V2 (caldo de lisogenia com sais V2) conforme a Tabela 1. Esterilize o meio de crescimento por autoclavagem. Deixe a mídia atingir a temperatura ambiente (RT). Armazene o excesso de mídia no RT.
   CUIDADO: Use equipamento de proteção individual (EPI) adequado e consulte as instruções específicas do laboratório ao operar uma autoclave.
2. Use um estoque de glicerol de V. natriegens do tipo selvagem para inocular 3 mL de meio LB-V2. Crescer durante a noite a 30 °C enquanto agita a 225 rpm.
3. Lave 1 mL da cultura durante a noite por centrifugação a 10.600 x g em uma centrífuga de bancada por 1 min. Aspire o sobrenadante sem perturbar o pellet resultante e ressuspenda em 1 mL de meio LB-V2 fresco.
4. Em um frasco Erlenmeyer defletor de 4 L autoclavado com tampa estéril, adicione 1 L de meio de crescimento LB-V2 fresco. Inocular com 1 ml de cultura lavada durante a noite (proporção de diluição de 1:1.000). Cultive a cultura a 30 °C enquanto agita a 225 rpm.
   NOTA: As culturas de V. natriegens podem ser aumentadas ou reduzidas , mantendo a proporção de diluição de 1:1.000. Por exemplo, adicione 250 μL de cultura lavada durante a noite a 250 mL de meio de crescimento LB-V2 fresco em um frasco Erlenmeyer defletor de 2 L com tampa estéril.
5. Monitore o OD₆₀₀ da cultura usando um espectrofotômetro. Quando a cultura atingir OD₆₀₀ = 1,0 ± 0,2, colher a cultura por centrifugação a 3.500 x g por 20 min a 4 °C. Coloque o pellet no gelo.
   NOTA: V. natriegens cresce rapidamente, portanto, é necessário um monitoramento rigoroso da cultura. O crescimento até OD₆₀₀ = 1,0 deve levar aproximadamente 1,5−2 h na proporção de diluição de 1:1.000.
6. Aspirar o sobrenadante e conservar imediatamente o sedimento bacteriano resultante a -80 °C ou proceder directamente à lise celular.
   NOTA: Esta etapa é um bom ponto de parada; no entanto, recomenda-se que o pellet seja processado imediatamente ou dentro de 1 a 2 dias para obter melhores resultados.

Tabela 1: Reagentes para a preparação de 1 L de meio de crescimento bacteriano LB-V2

Tabela 1 A	Preparação de meios de crescimento bacteriano LB-V2
Componente	Quantidade (g)	Concentração Final (mM)	Volume Final (L)
Caldo LB (Miller)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
Kcl	0.31	4.2
Tabela 1 B	Preparação do tampão de lise S30A
Componente	Quantidade (g)	Concentração Final (mM)	Volume Final (L)
Solução Tris (pH 8,0) - 1 M (mL)	25	50	0.5
Mg-glutamato	2.72	14
K-glutamato	6.10	60
Ditiotreitol (TDT) - 1 M (mL)	1	2

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de 2 mL	Eppendorf	22363352
HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfónico)	Sigma	H3375
Caldo LB (Luria-Bertani) (Miller)	Sigma	L3522
Cloreto de magnésio (MgCl₂)	Sigma	M8266
Cloreto de potássio (KCl)	Sigma	Pág. 9333
Cloreto de sódio (NaCl)	Sigma	S7653
Solução Tris (pH 8,0) - 1 M	Invitrogen	AM9856
Vibrio natriegens (tipo selvagem) Estoque liofilizado	ATCC	14048