Preparação de Extrato de Células Brutas de Vibrio natriegens

Resumo

Fonte: Wiegand, D. J., et al. Expressão de proteína livre de células usando a bactéria de crescimento rápido Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra a preparação de um extrato celular de Vibrio natriegens, uma bactéria de crescimento rápido conhecida por sua alta taxa de síntese de proteínas. O pellet bacteriano é lavado e ressuspenso em tampão de lise antes da sonicação no gelo para evitar a degradação celular. O lisado é centrifugado para separar os detritos celulares insolúveis e o extrato celular é coletado, congelado rapidamente e armazenado para uso futuro.

Protocolo

1. Preparação de Extratos de Células Brutas de V. natriegens – Cultura Bacteriana

1. Prepare o meio de crescimento bacteriano de V. natriegens , caldo de lisogenia versão 2 (LB-V2) conforme a Tabela 1. Esterilize o meio de crescimento por autoclavagem. Deixe a mídia atingir a temperatura ambiente (RT). Armazene o excesso de mídia no RT.
   CUIDADO: Use equipamento de proteção individual (EPI) adequado e consulte as instruções específicas do laboratório ao operar uma autoclave.
2. Use um estoque de glicerol de V. natriegens do tipo selvagem para inocular 3 mL de meio LB-V2. Crescer durante a noite a 30 °C enquanto agita a 225 rpm.
3. Lave 1 mL da cultura durante a noite por centrifugação a 10.600 x g em uma centrífuga de bancada por 1 min. Aspire o sobrenadante sem perturbar o pellet resultante e ressuspenda em 1 mL de meio LB-V2 fresco.
4. Em um frasco Erlenmeyer defletor de 4 L autoclavado com uma tampa estéril, adicione 1 L de meio de crescimento LB-V2 fresco. Inocular com 1 ml de cultura lavada durante a noite (proporção de diluição de 1:1.000). Cultive a cultura a 30 °C enquanto agita a 225 rpm.
   NOTA: As culturas de V. natriegens podem ser aumentadas ou reduzidas , mantendo a proporção de diluição de 1:1.000. Por exemplo, adicione 250 μL de cultura lavada durante a noite a 250 mL de meio de crescimento LB-V2 fresco em um frasco Erlenmeyer defletor de 2 L com tampa estéril.
5. Monitore o OD₆₀₀ da cultura usando um espectrofotômetro. Quando a cultura atingir OD₆₀₀ = 1,0 ± 0,2, colha a cultura por centrifugação a 3.500 x g por 20 min a 4 °C. Coloque o pellet no gelo.
   NOTA: V. natriegens cresce rapidamente, portanto, é necessário um monitoramento rigoroso da cultura. O crescimento até OD₆₀₀ = 1,0 deve levar aproximadamente 1,5−2 h na proporção de diluição de 1:1.000.
6. Aspirar o sobrenadante e conservar imediatamente o sedimento bacteriano resultante a -80 °C ou proceder directamente à lise celular descrita na secção 2.
   NOTA: Esta etapa é um bom ponto de parada; no entanto, recomenda-se que o pellet seja processado imediatamente ou dentro de 1 a 2 dias para obter melhores resultados.

2. Preparação de Extratos de Células Brutas de V. natriegens – Lise Celular

1. Prepare o tampão de lise S30 de acordo com a Tabela 1 em água deionizada estéril (DI) e ajuste o pH para 7,7 usando ácido acético glacial.
   CUIDADO: O ácido acético glacial deve ser manuseado com EPI adequado ao ajustar o pH.
2. Arrefecer o tampão de lise S30 a cerca de 4 °C no frigorífico ou no gelo antes de iniciar o procedimento de lise celular.
   NOTA: Para um resfriamento rápido, o tampão de lise pode ser colocado a -20 °C. Não permita que o buffer congele.
3. Coloque os grânulos de células no gelo por 10 a 20 minutos ou até que estejam completamente descongelados. Ressuspenda todos os pellets resultantes da mesma cultura de 1 L usando 10 mL de tampão de lise S30 frio e, em seguida, transfira a suspensão para um tubo de 50 mL. Se os pellets não forem congelados no congelador a -80 °C na etapa 1.6, prossiga diretamente para a ressuspensão.
   NOTA: Aumente o volume do tampão de lise S30 usado para ressuspender inicialmente os pellets conforme necessário.
4. Suspensão centrífuga a 3.500 x g durante 10 min a 4 °C. Aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Lave o pellet uma segunda vez usando 10 mL de tampão de lise S30 frio. Coloque o pellet no gelo.
5. Em uma câmara fria, adicione 500 μL de tampão de lise S30 frio ao pellet no tubo de 50 mL. Usando uma ponta de pipeta de diâmetro largo, ressuspenda o pellet e transfira cuidadosamente toda a suspensão do pellet para um tubo de 2 mL.
   NOTA: Se uma pipeta de diâmetro largo não estiver disponível, use uma tesoura para cortar a extremidade de uma ponta de pipeta de 1 mL para aumentar o orifício para transferência de pellets.
   1. Transfira o máximo de pellets possível sem aumentar significativamente o volume; no entanto, o pellet deve ser ressuspenso em líquido suficiente para ser sonicado, conforme indicado por uma suspensão homogênea no tubo de 2 mL. Não encha demais o tubo de 2 mL. A suspensão não deve exceder 1,5 mL; dividido em vários tubos, se necessário.
6. Mantenha o pellet celular no gelo e trabalhe em uma câmara fria. Encha um copo de 600 mL com gelo e coloque um suporte de tubo de 2 mL em cima do gelo.
   NOTA: É útil colocar o suporte do tubo próximo ao lado do béquer, de modo que a suspensão do pellet fique visível no gelo para monitorar o progresso da sonicação (veja a Figura 1).
7. Vortex suspendeu o pellet em um tubo de 2 mL brevemente para homogeneizar as células, sacuda os tubos para remover quaisquer células na parte inferior da tampa e coloque no suporte do tubo com a tampa aberta. Abaixe a ponta do sonicador na suspensão de modo que fique logo abaixo da superfície do líquido.
8. Prepare a configuração de sonicação conforme ilustrado na Figura 2 usando um sonicador e uma sonda com um diâmetro de ponta de 1/8 de polegada. Insira as seguintes configurações no controle do sonicador: frequência de 20 kHz e amplitude de 50%, tempo de ativação do pulso: 10 s, tempo de desligamento do pulso: 60 s.
9. Execute o protocolo de sonicação de pulso por três ciclos. Se o volume total da suspensão de pellets for > 500 μL, execute o protocolo de sonicação por pulso seis vezes.
   NOTA: Geralmente, 3−6 pulsos são suficientes para lisar pastilhas de V. natriegens ; Pulsos adicionais podem ser necessários dependendo do sonicador. Durante a sonicação, use a plataforma do botão de ajuste para mover a sonda para cima e para baixo para lisar qualquer pellet que possa ter se depositado no fundo do tubo. O tubo pode ser removido do suporte e brevemente vórtice para rehomogeneizar a suspensão entre os pulsos.
   CUIDADO: Use proteção auditiva adequada quando o sonicador estiver ativo.
10. Após a sonicação, centrifugue o extrato de células brutas a 16.000 x g por 30-45 min a 4 ° C ou até que o lisado esteja livre de quaisquer detritos celulares, conforme ilustrado na Figura 3.
11. Em uma câmara fria, alíquota de 50 μL dos sobrenadantes resultantes para novos tubos de 2 mL sem perturbar o pellet.
    NOTA: Quaisquer detritos transferidos acidentalmente para os novos tubos de 2 mL reduzirão drasticamente a capacidade do extrato de síntese de proteínas de alto rendimento.
12. Congele rapidamente os extratos de células brutas colocando os tubos em um suporte de tubo com um cordão de imersão conectado, conforme ilustrado na Figura 4. Mergulhe os tubos em um Dewar contendo nitrogênio líquido e coloque-os imediatamente em um freezer a -80 °C até o uso. CUIDADO: Use EPI apropriado para manusear nitrogênio líquido, incluindo jaleco, óculos de segurança, protetor facial, avental criogênico e luvas.

Tabela 1: Reagentes para a preparação de 1 L de meio de crescimento bacteriano LB-V2 e 0,5 L de tampão de lise celular S30A.

Tabela 1 A	Preparação de meios de crescimento bacteriano LB-V2
Componente	Quantidade (g)	Concentração Final (mM)	Volume Final (L)
Caldo LB (Miller)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
Kcl	0.31	4.2
Tabela 1 B	Preparação do tampão de lise S30A
Componente	Quantidade (g)	Concentração Final (mM)	Volume Final (L)
Solução de Tris (pH 8,0) - 1 M (mL)*	25	50	0.5
Mg-glutamato	2.72	14
K-glutamato	6.10	60
Ditiotreitol (TDT) - 1 M (mL)*	1	2

Resultados

Figura 1: Uma visão aproximada do béquer e do suporte do tubo na plataforma de sonicação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de 15 mL	Corning	352196
Tubos de 2 mL	Eppendorf	22363352
Tubos de 50 mL	Corning	352070
Garrafa Dewar - 4L	ThermoScientific	10-194-100C
Sal de hemimagnésio do ácido L-glutâmico tetrahidratado	Sigma	49605
Sal de potássio de ácido L-glutâmico monohidratado	Sigma	G1149
Caldo LB (Miller)	Sigma	L3522
Cloreto de magnésio (MgCl₂)	Sigma	M8266
Cloreto de potássio (KCl)	Sigma	Pág. 9333
Pellets de hidróxido de potássio	Sigma/Roche	1050121000
Sonicador Q125 e sonda CL-18	Qsonica	4422
Cloreto de sódio (NaCl)	Sigma	S7653
Vibrio natriegens (tipo selvagem) Estoque liofilizado	ATCC	14048