Expressão de proteína livre de células usando um extrato de células brutas bacterianas

Resumo

Fonte: Wiegand, D. J., et al. Expressão de proteína livre de células usando a bactéria de crescimento rápido Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra o uso de um sistema de expressão de proteínas livres de células bacterianas baseado em lisado bruto de Vibrio natriegens para realizar transcrição e tradução in vitro acopladas. Ele destaca a preparação de uma mistura mestre com componentes essenciais e a síntese passo a passo de proteínas funcionais a partir de um molde de DNA.

Protocolo

1. Preparação de componentes de reação sem células

1. Componentes gerais da reação
   1. Preparar os estoques de trabalho de Mg-glutamato e K-glutamato em tubos de 50 mL com água DI estéril (desionizada) nas concentrações de 100 mM e 2000 mM, respectivamente.
   2. Prepare um estoque de trabalho de 50% (p / v) de polietilenoglicol (PEG) -8000 adicionando 100 mL de água DI estéril a um béquer de 250 mL. Coloque um pequeno agitador magnético no copo. Pesar 50 g de PEG-8000 e adicionar aos 100 ml de água no copo.
   3. Coloque o copo em uma placa de agitação aquecida regulada para 100 °C e agite a 250 rpm até que o PEG-8000 esteja em solução. Deixe a mistura líquida PEG-8000 esfriar antes de transferir para tubos de 50 mL.
2. Master mix de soluções energéticas
   1. Prepare uma solução 5 M de KOH adicionando 140 g de pellets KOH a 500 mL de água DI estéril.
      CUIDADO: Prepare esta solução em uma capa química e use EPI ao manusear bases fortes. A solução ficará quente, então a tampa do frasco deve estar solta para evitar o acúmulo de pressão. Deixe a solução KOH atingir RT antes de usar.
   2. Prepare um tampão HEPES-KOH de 1750 mM adicionando 20,85 g de HEPES a um frasco de 100 mL. Adicione lentamente água DI estéril até que o volume atinja 40 mL. Garrafa de vórtice para dissolver o HEPES. Use a solução de KOH 5 M para ajustar o pH para 8,0 e, em seguida, aumente o volume da solução para 50 mL.
      CUIDADO: O KOH deve ser manuseado com EPI adequado ao ajustar o pH.
   3. Prepare os restantes componentes da matéria-prima da mistura energética 10x nas concentrações indicadas no Quadro 1 em água DI estéril e coloque cada massa no gelo. Descongele os estoques de 100 mM ATP, GTP, CTP e UTP em RT e coloque no gelo.
      NOTA: Um termomisturador regulado para 37 °C e 350 rpm pode ser usado para dissolver os reagentes na solução, se necessário. Não superaqueça ou deixe reagentes no termomixer por um longo período de tempo.
   4. Em um tubo de 15 mL, adicione cada componente da mistura principal da solução energética de acordo com a ordem e o volume especificados na Tabela 1. Vortex a solução após a adição de cada componente. Isso fará com que 5 mL de master mix de solução de energia 10x.
   5. Divida o master mix de solução energética 10x em alíquotas de 200 μL em tubos de 2 mL. Congele rapidamente cada alíquota. Coloque-os imediatamente no freezer a -80 °C até o uso.
3. Master mix de aminoácidos
   1. Para preparar uma mistura master de aminoácidos 4x fresca, comece descongelando cada estoque de aminoácidos em RT e depois colocando cada um no gelo. Use um vórtice e/ou termomisturador ajustado a 37 °C e 350 rpm para garantir que todos os estoques de aminoácidos estejam totalmente dissolvidos.
      NOTA: A cisteína pode não se dissolver totalmente; Pode ser adicionado ao Amino Acid Master Mix como uma suspensão. Não superaqueça ou deixe reagentes no termomixer por um longo período de tempo.
   2. Em um tubo de 15 mL, adicione o volume apropriado de aminoácidos à água DI estéril para que a concentração final de cada um seja de 8 mM na seguinte ordem: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, HIS, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR, LEU e CYS. Depois de adicionar cada aminoácido, faça um vórtice com a solução da mistura principal. Os volumes listados na Tabela 1 constituirão 2,4 mL de master mix de aminoácidos.
   3. Divida a mistura principal de aminoácidos 4x em alíquotas de 200 μL em tubos de 2 mL. Congele rapidamente cada alíquota. Coloque imediatamente no freezer a -80 °C até o uso.
4. Produção de molde de DNA de plasmídeo pronto para reação
   NOTA: A expressão de proteínas livres de células neste sistema foi otimizada usando o vetor de expressão de proteína fluorescente verde (GFP) T7-pJL1-sfGFP (Tabela de Materiais). Recomenda-se usar este plasmídeo como controle da eficiência da reação livre de células e o esqueleto pJL1 para a clonagem e expressão de outras sequências de proteínas. Outros modelos de DNA de plasmídeo podem ser usados; no entanto, é importante notar que a transcrição é controlada por uma sequência promotora de T7 e pela presença de RNA polimerase T7. Um protocolo simples para a produção em larga escala de qualquer molde de DNA de plasmídeo a partir de E. coli transformada é descrito abaixo.
   1. Purifique o vetor desejado usando um kit de purificação de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). NOTA: Recomenda-se concentrar o molde de DNA do plasmídeo o máximo possível para atender às restrições de volume apertadas da reação livre de células. Em geral, procure um estoque de trabalho de 750 a 1500 ng / μL.

2. Realização de reações de expressão de proteínas livres de células usando extrato bruto de V. natriegens

1. Expressão de proteínas livres de células usando plasmídeo ou molde de DNA linear
   1. Remova 10x mix mestre de solução energética e 4x alíquotas de mistura mestre de aminoácidos do freezer a -80 ° C, descongele em RT e coloque no gelo. Remova os estoques de RNA polimerase T7 e inibidores de RNase do freezer a -20 ° C e coloque-os no gelo. Descongele o molde de DNA em RT e coloque no gelo.
   2. Prepare uma mistura mestre de reação livre de células de acordo com a Tabela 2 , adicionando cada componente na seguinte ordem a um tubo de 2 mL no gelo: mistura principal de aminoácidos, mistura principal de solução energética, Mg-glutamato, K-glutamato, molde de DNA, PEG-8000, T7 RNA polimerase e inibidor de RNase. Agite suavemente o tubo após cada adição à mistura principal.
      NOTA: Se um molde linear for usado para expressão de proteína livre de células, adicione 5−10x mais material em comparação com o molde de plasmídeo para obter rendimentos apreciáveis de proteína.
   3. Remova o lisado de células brutas de V. natriegens dos freezers a -80 ° C e coloque no gelo por 10 a 20 minutos até descongelar. Adicionar o volume adequado de extracto de células brutas à mistura principal de reacção sem células, de acordo com o quadro 2 , e homogeneizar delicadamente, agitando ou pipetando para cima e para baixo.
   4. Expressão de proteína livre de células de ponto final usando um termociclador
      1. Pipetar 10 μL da mistura principal de reação livre de células para o fundo de uma placa de PCR de 96 ou 384 poços. Entre cada transferência para a placa PCR, misture a mistura principal sacudindo o tubo suavemente.
         NOTA: A mistura mestre de reação livre de células deve ser bem misturada em todos os momentos para maximizar a reprodutibilidade da reação e a expressão de proteínas livres de células em todas as amostras.
   5. Centrifugue brevemente a placa a 1.000 x g por 10 s para agrupar qualquer mistura principal que possa ter ficado presa nas laterais dos poços. Selar os poços com um adesivo de placa para evitar a evaporação e, em seguida, colocar a placa PCR num termociclador regulado para 26 °C com uma tampa aquecida regulada para 105 °C.
      NOTA: A distribuição uniforme de calor e a tampa aquecida de um termociclador melhoram muito os rendimentos de expressão de proteínas.
   6. Incubar as reações livres de células por um mínimo de 3 h. Após a incubação, as proteínas expressas podem ser purificadas, quantificadas e usadas para processos a jusante.
      NOTA: As proteínas expressas podem ser quantificadas diretamente na reação livre de células usando um método de escolha do usuário. Por exemplo, as proteínas fluorescentes podem ser quantificadas usando uma curva padrão externa, ou a radioatividade pode ser medida se estiver usando um aminoácido radiomarcado na reação livre de células. A espectroscopia UV-visível ou os ensaios de proteínas totais geralmente não são recomendados para medir diretamente a produção de proteínas em reações livres de células sem uma purificação inicial.

Tabela 1: Reagentes para a preparação de 5 mL de master mix de solução energética 10x e 2,4 mL de master mix de aminoácidos 4x.

Preparação do Master Mix
Componente	Concentração de estoque (mM)	Concentração Final (mM)	Quantidade (μL)	Volume Final (μL)
HEPES-KOH pH 8	1750	500	1428.57	5000
ATP	100	15	750.00
GTP	100	15	750.00
CTP	100	9	450.00
UTP	100	9	450.00
tRNA de E. coli MRE 600 (mg/mL)*	100	2	100.00
Coenzima A Hidrato	200	2.6	65.00
NAD	200	3.3	82.50
acampamento	650	7.5	57.69
Ácido folínico	100	0.7	35.00
Espermidina	1600	10	31.25
3-PGA	2000	300	750.00
Água deionizada estéril			49.99
	Preparação de 4x Amino Acid Master Mix
Componente	Concentração de estoque (mM)	Concentração Final (mM)	Quantidade (μL)	Volume Final (μL)
ALA	168	8	114.3	2400
ARG	168	8	114.3
ASN	168	8	114.3
ÁSPIDE	168	8	114.3
Boa sorte	168	8	114.3
GLU	168	8	114.3
GLY	168	8	114.3
DELE	168	8	114.3
MENTIR	168	8	114.3
LYS	168	8	114.3
CONHECI	168	8	114.3
PHE	168	8	114.3
PRÓ	168	8	114.3
SOR	168	8	114.3
LÁ	168	8	114.3
VAL	168	8	114.3
TRP	168	8	114.3
TYR	168	8	114.3
LEU	140	8	137.1
CYS	168	8	114.3
Água deionizada estéril			91.4

de Soluções Energéticas 10x

Tabela 2: Componentes da mistura mestre de reação livre de células otimizada de V. natriegens para molde de DNA

Master Mix de reação sem células
Componente	Concentração de estoque (mM)	Concentração Final (mM)	Quantidade (μL) 1x Reação	Quantidade (μL) 50x Reações
Extrato (%)		25	2.50	125.00
Mg-glutamato	100	3.5	0.35	17.50
K-glutamato	2000	80	0.40	20.00
4x Mistura Mestre de Aminoácidos	8.0	2	2.50	125.00
10x Solução Energética Master Mix			1.00	50.00
DNA plasmidial (ng/μL)	1000	500	0.50	25.00
50% PEG-8000 (%)	50	2	0.40	20.00
RNA polimerase T7			1.00	50.00
Inibidor de RNase Murino			0.10	5.00
Água deionizada estéril			1.25	62.50
Volume de reação (μL):	10

Materiais