Monitoramento em tempo real do crescimento bacteriano usando um sistema de cultura de microgotículas microfluídica

Resumo

Fonte: Jian, X. et. al., Cultivo Microbiano Automatizado e Evolução Adaptativa usando o Sistema de Cultura de Microgotículas Microbianas (MMC). J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra o uso de uma plataforma baseada em gotículas microfluídicas para monitoramento em tempo real do crescimento bacteriano. Ao gerar gotículas uniformes contendo suspensões bacterianas e guiá-las através de uma via de detecção, o sistema permite a medição óptica contínua da densidade celular para construir uma curva de crescimento.

Protocolo

1. Preparativos

1. Conecte a agulha da seringa (o diâmetro interno é de 0.41 mm e o diâmetro externo é de 0.71 mm), o conector rápido A e o frasco de reagente (Figura 1C) e autoclave-os a 121 °C por 15 min.
   NOTA: Desaperte ligeiramente a tampa do frasco de reagente durante a esterilização. Mais alguns frascos de reagentes podem ser preparados a cada vez para uso.
2. Use um filtro de fluoreto de polivinilideno (PVDF) de 0,22 μm para filtrar o óleo do sistema de cultura de microgotículas (MMC). Coloque o chip microfluídico (Figura 1B) e o óleo MMC na bancada limpa com antecedência e esterilize-os por irradiação ultravioleta por 30 minutos antes de usar.
   NOTA: Para obter detalhes sobre o conector rápido A, frasco de reagente, óleo MMC e chip microfluídico, consulte a Tabela de Materiais.
3. Instale o chip microfluídico
   1. Abra a porta da câmara de operação (Figura 1A) e levante a sonda de fibra óptica.
   2. Alinhe os orifícios do campo elétrico com as agulhas do campo elétrico e coloque suavemente o chip no pedestal do chip. Em seguida, insira as duas colunas de posicionamento nos orifícios de posicionamento e coloque a sonda de fibra óptica (Figura 1D).
   3. Conecte o conector rápido A no chip à porta correspondente do MMC de acordo com o número da posição (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Em seguida, feche a porta da câmara de operação.
4. Reabasteça o óleo MMC (até cerca de 80 mL) no frasco de óleo e esvazie o líquido residual no frasco de resíduos antes de usar.
   NOTA: O líquido residual geralmente é lixo orgânico. Consulte a lei e regulamentação regional após o descarte, sujeito a alterações com base na configuração experimental.

2. Medição da curva de crescimento em MMC

1. Preparação para a solução bacteriana inicial
   1. Siga os regulamentos padrão relacionados para preparar o meio Luria-Bertani (LB) e a autoclave a 121°C por 15 min.
      NOTA: Componentes do meio LB: NaCl (10 g/L), extrato de levedura (5 g/L) e triptona (10 g/L).
   2. Retire a cepa de Escherichia coli (E. coli) MG1655 do estoque de glicerol e cultive-a em um frasco agitado de 50 mL com 10 mL de meio LB em uma incubadora agitada (200 rpm) a 37 ° C por 5-8 h.
      NOTA: O tempo de cultivo depende das estirpes específicas. É ideal cultivar a cepa no período/fase logarítmica.
   3. Diluir a solução cultivada de E. coli MG1655 com meio fresco até uma densidade óptica de 600 nanômetros (OD₆₀₀) de 0,05-0,1 para obter uma solução bacteriana inicial (preparar cerca de 10 mL).
2. Clique em Inicialização para inicializar o MMC. Depois que a interface de inicialização aparecer, defina a temperatura de cultivo como 37 °C e o valor do sinal fotoelétrico como 0.6 (Figura 2A). A inicialização levará cerca de 20 minutos.
3. Ligue a lâmpada ultravioleta (UV) (comprimento de onda 254 nm) durante a inicialização.
4. Injete a solução inicial de bactérias e o óleo MMC no frasco de reagente.
   1. Retire um frasco de reagente esterilizado na bancada limpa e aperte a tampa.
   2. Use uma seringa estéril de 10 mL para injetar 3-5 mL de óleo MMC da agulha da seringa do tubo lateral. Incline e gire o frasco de reagente lentamente para que o óleo se infiltre totalmente na parede interna.
   3. Injete cerca de 5 mL de solução bacteriana inicial e, em seguida, encha o frasco de reagente injetando 5-7 mL do óleo novamente.
   4. Retire o conector rápido independente A e insira o conector rápido A do frasco de reagente em seu conector rápido B para concluir a operação de injeção de amostra (Figura 3A).
5. Aguarde o término da inicialização e desligue a lâmpada UV (comprimento de onda de 254 nm).
6. Abra a porta da câmara de operação e coloque o frasco de reagente no banho de metal.
7. Retire o conector C2 do chip e o conector rápido A do frasco de reagente. Conecte o conector do tubo lateral do frasco de reagente ao conector C2 e o conector do tubo superior ao conector O2. Em seguida, feche a porta da câmara de operação.
8. Clique em Curva de Crescimento para escolher a função de medição da curva de crescimento (Figura 2A). Na interface de configuração de parâmetros, insira o número como 15, ligue a chave de detecção de OD e defina o comprimento de onda como 600 nm. Clique em Iniciar para iniciar a geração de droplets. Isso levará cerca de 10 minutos. NOTA: Aqui, Número refere-se ao número de gotículas a serem geradas. Comprimento de onda refere-se ao comprimento de onda do OD a ser detectado. Defina o número (máximo 200) e o comprimento de onda (350-800 nm) de acordo com os requisitos do experimento.
9. Quando uma janela pop-up aparecer na interface principal solicitando "Remova o frasco de reagente entre C2 e O2 e, em seguida, clique no botão OK após a conclusão", abra a porta da câmara de operação para retirar o frasco de reagente e conecte os conectores C2 e O2.
10. Feche a porta e clique no botão OK na janela pop-up para cultivar automaticamente as gotículas e detectar os valores de OD.
    NOTA: O MMC detecta o valor OD quando a gota passa pela sonda de fibra óptica. Portanto, o período de detecção depende do número de gotículas geradas.
11. Quando a curva de crescimento atingir a fase estacionária, clique no botão Exportação de dados para exportar os dados de OD. Selecione o caminho de salvamento de dados e exporte o valor OD registrado durante o período de cultivo no formato .csv, que pode ser aberto pelo software apropriado (por exemplo, Microsoft Excel). Em seguida, use um software de mapeamento (por exemplo, EXCEL e Origin 9.0) para traçar a curva de crescimento.
    NOTA: Durante o processo de cultivo, é possível clicar em Exportar Dados a qualquer momento para exportar os dados OD de todas as gotículas atuais.

Resultados

Figura 1: Estrutura e ferramentas essenciais do MMC. (A) Câmara externa e operacional da MMC. (B) O chip microfluídico do MMC. O chip tem sete canais (C1-C6 e CF). (C) Frasco de reagente. Tem um tubo superior e um tubo lateral. Antes de injetar a amostra ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Membrana filtrante PVDF de 0,22 μm	Merck Millipore Ltd.	SLGPR33RB	Esterilize o óleo MMC
Geladeira 4 °C	Haier	BCD-289BSW	Para armazenamento de reagentes
Ágar	Becton, Dickinson e Companhia	214010	Para preparação de chapas sólidas
Banco limpo	Pequim Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.	DL-CJ-INDII	Para operação asséptica e esterilização UV
Computador	Lenovo	E450	Instalação de software e controle MMC
Incubadora de temperatura constante	Instrumento científico co do qixin de Shanghai, LTD	LRH 250	Para o cultivo microbiano em meio sólido
Balança eletrônica	OHAUS	AR 3130	Para pesagem de reagentes
Tubo EP	Thermo Fisher	1,5 mL	Para coleta de gotículas
Tubo de congelamento	Thermo Fisher	2,0 mL	Para preservação de cepas
Glicerol	REAGENTE GERAL	G66258A	Para preservação de cepas
Pote de esterilização a vapor de alta pressão	SANYO Elétrico	MLS3020	Para esterilização em autoclave
Sistema de cultura de microgotículas microbianas (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Realização de determinação da curva de crescimento e evolução adaptativa. Consulte http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Chip microfluídico	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	Para várias operações de gotículas. Consulte http://www.tmaxtree.com/en/
Óleo MMC	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	A fase oleosa para microfluídica de gotículas. Consulte http://www.tmaxtree.com/en/
NaCl	REAGENTE GERAL	G81793J	Componente do meio LB
Placa de Petri	Corning Incorporada	90 milímetros	Para a preparação de meio sólido
Pipeta	Eppendorf	2,5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	Para manuseio de líquidos
Conector rápido A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	Para a conexão de cada junta. Consulte http://www.tmaxtree.com/en/
Frasco de reagente	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	Amostragem e armazenamento de solução bacteriana e reagentes. Consulte http://www.tmaxtree.com/en/
Agitar balão	União-Biotecnologia	50 mL	Para cultivo microbiano
Incubadora de agitação	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	Para o cultivo microbiano em frasco agitado
Seringa	JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD	10 mL	Retire o líquido e injete-o no frasco de reagente
Agulha de seringa	Loja de ferragens OUBEL	22G	O diâmetro interno é de 0,41 mm e o diâmetro externo é de 0,71 mm.
Triptona	Oxóide Ltda.	LP0042	Componente do meio LB
Geladeira de temperatura ultrabaixa	SANYO Ultra-baixo	MDF-U4086S	Para preservação de cepas (-80 °C)
Espectrofotômetro UV-Vis	Companhia Elétrica Geral	Ultrospec 3100 pro	Para a medição de valores de DO
Extrato de levedura	Oxóide Ltda.	LP0021	Componente do meio LB