Transformação natural e expressão de GFP na lacuna filamentosa de Cyanobacterium Phormidium

Resumo

Fonte: Weber, N., et al., Transformação Natural, Expressão de Proteínas e Crioconservação da Cianobactéria Filamentosa Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo descreve um procedimento para realizar a transformação natural em cianobactérias filamentosas usando DNA de plasmídeo para obter expressão estável de GFP e resistência a antibióticos por meio de recombinação homóloga.

Protocolo

1. Transformação natural e expressão de GFP

NOTA: A transformação é baseada em um vetor plasmidial propagado em Escherichia coli (E. coli); pGEM-T ou pUC19 podem ser usados como vetores de backbone. Exemplos de vetores para a expressão da proteína fluorescente verde da superpasta (sfGFP) são descritos na seção de resultados representativos.

1. Execute todas as etapas usando material estéril em condições laboratoriais estéreis (bancada limpa, vidraria estéril).
2. Inocular 2 x 50 ml de meio líquido f/2 em dois frascos de 250 ml com 2 x 1 ml de filamentos de Phormidium lacuna (P. lacuna) provenientes de uma cultura em execução. Cultive em luz branca (50 μmol ^{m-2 s-1}) sob agitação (rotação horizontal, 50 rpm) por ~ 5 dias a 25 ° C.
3. Prepare ~ 200 μg do DNA do vetor de transformação usando um kit de preparação midi de acordo com as instruções do fabricante.
4. Homogeneizar 100 mL de suspensão de célula de P. lacuna (ver Tabela de Materiais) a 10.000 rpm por 3 min. Meça OD a 750 nm (valor desejado = 0,35).
5. Centrifugue a suspensão da célula por 15 min a 6.000 × g. Remova o sobrenadante e suspenda o pellet em 800 μL (volume total incluindo líquido residual e filamentos) do líquido restante e do meio f/2⁺ adicional.
6. Pegue oito placas de bacto-ágar f/2⁺ (10 cm de diâmetro) contendo 120 μg/mL de canamicina. Pipetar 10 μg de ADN para o meio de cada placa de ágar. Pipetar imediatamente 100 μL de suspensão celular no meio de cada placa de ágar (em cima do ADN).
7. Mantenha a placa de ágar sem tampa na bancada limpa para permitir que o excesso de líquido evapore. Feche a placa e cultive-a em luz branca a 25 °C por 2 dias.
8. Distribuir os filamentos de cada placa de ágar-ágar com uma alça de inoculação em várias placas de bacto-ágar f/2⁺ frescas contendo 120 μg/ml de canamicina. Cultivar as placas à luz branca a 25 °C e verificar regularmente as culturas ao microscópio.
9. Identifique filamentos vivos e transformados após 7-28 dias ao microscópio. Procure filamentos verdes saudáveis (Figura 1) que sejam diferentes de outros filamentos. Se esses filamentos verdes puderem ser identificados, continue com a próxima etapa; caso contrário, guarde o prato por mais 7 dias.
10. Use uma pinça para transferir esses filamentos vivos identificados para 50 mL de meio líquido f / 2⁺ com 250 μg / mL de canamicina. Cultivar em luz branca a 25 °C num shaker (rotação horizontal, 50 rpm). Observe o crescimento por até quatro semanas.
11. Transferir os filamentos de volta para um meio de ágar contendo 250 μg/ml de canamicina e esperar que os filamentos cresçam. Após vários dias, transfira filamentos individuais para uma placa de ágar fresca com uma concentração mais alta de canamicina, por exemplo, 500 μg / mL. Mantenha a placa original.
12. Certifique-se de que os filamentos sejam propagados em alta concentração de canamicina em cultura líquida ou em ágar. Aumente a concentração de canamicina novamente para acelerar a segregação. NOTA: P. lacuna transformada cresce em até 10.000 μg/mL de canamicina. Outras espécies podem não tolerar concentrações tão altas.
13. Para expressão de GFP: observe filamentos individuais com um microscópio de fluorescência em uma ampliação da objetiva definida em 40x ou 63x. Capture uma imagem de transmissão de campo claro e uma imagem de fluorescência. Use as seguintes configurações para GFP: passagem de banda de 470 nm para excitação, passagem de banda de 525 nm para emissão e um divisor de feixe de 495 nm, tempo de exposição inicial de 500 ms.
14. Ajuste o tempo de exposição para sinais de fluorescência claros, evitando intensidades de saturação. Tente usar a mesma configuração para todas as amostras.
15. Como os filamentos do tipo selvagem também exibirão fluorescência, capture imagens com as mesmas configurações acima para esta fluorescência de fundo.NOTA: A cepa que expressa GFP deve ter um sinal mais alto; caso contrário, não está expressando GFP.
16. Com base nos tempos de exposição e nas intensidades de pixel das imagens de fluorescência, calcule e compare o conteúdo de GFP dos diferentes filamentos.

Resultados

Figura 1. Filamentos de lacuna de Phormidium 5 semanas após a transformação. O vetor de expressão sfGFP pMH1 foi usado; a seleção ocorreu em meio f/2 com 120 μg/mL de canamicina. Os fil...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ágar Bacto	OttoNorwald	214010
Microscópio de fluorescência ApoTome	Zeiss
Microscópio de fluorescência Axio Imager 2	Zeiss
Canamicina	Sigma-Aldrich	25389-94-0
Microscópio DM750	Zeiss
Kit de extração de plasmídeo de preparação Midi NucleoBond Xtra Midi kit	Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG	REF740410,50
Fonte de luz, tubo fluorescente L18W/954 luz do dia	OSRAM		Cultivo de cianobactérias
Fonte de luz, painel LED XL 6500K 140 W	Estrela Bloom	N/A	Cultivo de cianobactérias
Placas de Petri poliestirol, 100 mm x 20 mm	Merck	Pág. 5606-400EA
Poliestirol de placas de Petri, 60 mm x 15 mm	Merck	Pág. P5481-500EA
Pipetman 100-1.000 μL	Gilson	SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 μL	Gilson	SKU: FA10004M
Pipetas de plástico 10 mL, estéreis	Greiner	607107
Shaker Unimax 2010	Instrumentos Heidolph		Para cultivo
Tubo de plástico, estéril, 50 mL	Greiner	227261
Ultraturrax Britador Silencioso M	Instrumentos Heidolph		Homogeneizador
F / 2 + meio líquido	f/2-médio, com NaNO₃ e NaH₂PO₄ 10 vezes maiores (NaNO₃ 0,88 mM, NaH₂PO₄ 36 μM
F/2+-ágar	3% (m/v) de bacto ágar, água do mar artificial, 0,1% (v/v) de solução de oligoelementos, 0,05% (v/v) de solução vitamínica, 8,8 mM de NaNO₃, 0,36 mM de NaH₂PO₄