Geração de Filmes Bacterianos Nanocelulose Embutidos em Magnetita

Resumo

Fonte: Arias, S. L., et al. Fabricação de uma nanocelulose bacteriana magnética funcionalizada com nanopartículas de óxido de ferro. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a síntese in situ de nanopartículas de magnetita dentro de uma película bacteriana de nanocelulose produzida por Gluconacetobacter xylinus. Ele explica como a nanocelulose bacteriana magnética é gerada por infusão de íons de ferro, precipitação alcalina e purificação.

Protocolo

1. Síntese de nanopartículas de óxido de ferro revestidas por polímero e sua deposição em uma membrana de nanocelulose bacteriana (BNC)

1. Faça bolhas em 1.000 ml de água de alta pureza com gás nitrogênio para remover qualquer oxigênio dissolvido na água e substituí-lo por nitrogênio.
2. Use um cantil de três gargalos de fundo redondo para preparar uma solução em proporção molar de cloreto de ferro (III) hexahidratado (FeCl_{3,6H 2O}) e cloreto de ferro (II) tetrahidratado (FeCl_{2,4H 2}O) diluído com água desoxigenada de alta pureza. Por exemplo, use 5,4 g de FeCl_{3,6H 2}O e 1,98 g de FeCl 2,4H₂O em 10 ml de água desoxigenada de alta pureza. Se essa preparação ficar muito viscosa e difícil de mexer, use 0,54 g de FeCl_{3,6H 2}O e 0,198 g de FeCl 2,4H₂O em 20 ml de água desoxigenada de alta pureza.
   NOTA: Reduza o tempo de exposição do FeCl 2,4H ₂O ao ar pesando esse composto químico o mais rápido possível. Uma vez introduzido no frasco de fundo redondo de três braços, feche o frasco de fundo redondo de três braços com tampões de septo até que ele esteja conectado ao suprimento de gás nitrogênio e ao tubo do condensador.
3. Use dois gargantos do recipiente para garantir uma entrada e saída constante de gás nitrogênio, conectando o suprimento de gás nitrogênio a uma agulha perfurada em uma rolha de septo e fixada nos pescoços do vaso.
4. Coloque 1 película BNC (15,6 mm de diâmetro e 2-3 mm de espessura) no recipiente com os reagentes. Certifique-se de que a amostra esteja completamente submersa no líquido.
5. Conecte o braço restante do vaso a um tubo condensador. Além disso, use um tubo de secagem cheio de sulfato de cálcio anidro no topo do tubo condensador. Faça a água passar pelo tubo do condensador.
6. Sele todas as juntas de vidro com graxa a vácuo.
7. Aqueça a solução em um banho de óleo de silicone a 80 °C usando uma placa de agitação e mantenha essa temperatura até a etapa 1.10. Use uma pequena barra magnética para misturar os reagentes a 350 rpm por 5 minutos. Certifique-se de que o BNC esteja devidamente impregnado com a solução ferrosa e que os reagentes estejam completamente dissolvidos. Continue mexendo a mistura até o final do experimento.
   NOTA: Use um termômetro para verificar a temperatura do óleo de silicone. Deve estar estável até 80 °C.
8. Aumente a velocidade de agitação para 700 rpm e adicione (por meio do drop), em um intervalo de 5 minutos, 5 ml de hidróxido de amônio (NH₄OH, 14%) aos 10 ml de solução ferrosa usando uma agulha de pipetear, que também foi inserida em um tampão de septo. Após a adição do hidróxido de amônio, a cor da solução muda de amarelo/laranja para preto.
9. Continue mexendo a solução a 80 °C por mais 5 minutos. Evite agitações em alta velocidade para manter a integridade da amostra. Altas velocidades, ou seja, superiores a 1.000 rpm, podem destruir a amostra.
10. Baixe a temperatura da solução para 30 °C usando o fundo de controle de temperatura da placa de agitação e continue mexendo por mais 5 minutos. Depois, desligue a placa elétrica. Neste ponto, as nanopartículas de óxido de ferro (IONPs) foram incorporadas à malha BNC.
11. Resfrie a mistura até a temperatura ambiente (RT) e separe as nanopartículas magnéticas (MNPs) e o BNC usando um ímã permanente forte (por exemplo, 1 Tesla). Para isso, transfira a mistura para um frasco de recipiente e, mantendo o ímã próximo ao recipiente, mantenha os MNPs e o BNC no lugar enquanto decanta o sobrenadante.
    Nota: Tenha cuidado ao manusear ímãs fortes, pois eles podem ser prejudiciais quando usados incorretamente. Para as etapas (1.12) - (1.14) e (1.16), use a água de alta pureza desoxigenada preparada anteriormente em (1.1) para evitar a oxidação das partículas.
12. Resuspenda os MNPs e BNC em 100 ml de água. Agite suavemente a solução para remover todos os MNPs que não estejam fortemente incorporados ao BNC. Decante o sobrenadante novamente mantendo os MNPs e o BNC no lugar usando o ímã.
13. Lave os MNPs e o BNC várias vezes com água até que o sobrenadante atinja pH neutro (pH~7), medido usando uma tira colorimétrica.
14. Separe o BNC funcionalizado magneticamente ou nanocelulose bacteriana magnética (MBNC) dos MNPs usando uma pinça e enxágue o MBNC várias vezes com água até que a água fique clara.
15. Esterilize o MBNC expondo o MBNC O/N à UV (110-280 nm).
16. Autoclave 500 ml de água desoxigenada de alta pureza a 120 °C por 20 minutos e armazene o MBNC em 20 ml dessa água.
17. Assépticamente, imerga a amostra em 1% de polietilenoglicol (PEG) e mexa por 2 horas em RT (37 °C). Esse procedimento melhora a biocompatibilidade e a estabilidade das nanopartículas de óxido de ferro depositadas no BNC, especificamente aquelas expostas na superfície. O revestimento PEG será distribuído pela rede 3D MBNC.
    NOTA: Os IONPs nus são facilmente oxidados no ar devido à sua alta atividade química. Embora o PEG seja considerado um material não biodegradável, sua estabilidade química depende das condições biológicas aplicadas, como teor de água, pH, temperatura, presença de enzimas, espécies reativas de oxigênio, espécies reativas de nitrogênio e outras.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Glucoacetobacter xylinus	ATCC	700178
Cloreto de ferro(III) hexahidratado	Sigma Aldrich	236489-100G
Hidróxido de Amônio	Macron Fine Chemicals	6665-46
Poli (Etilenoglicol), média Mn 400	Sigma Aldrich	202398-250G
Cloreto de ferro (II) tetrahidratado	Sigma Aldrich	44939-250G
Sulfato de cálcio anidro	Drierita W.A. Hammond	13001
Gordura de alto vácuo	Sigma Aldrich	Z273554-1EA
Tiras de teste de pH	Sigma Aldrich	P4786-100EA
Frasco destilador do tipo três ângulos de braço com fundo arredondado	Sigma-Aldrich	CLS4965250
Óleo de silicone para banhos de óleo	Sigma-Aldrich	85409-250ML
Tubo de secagem	Chemglass	CG-1295-01
Tampa de septo, tipo manga	Chemglass	CG-3022-98
Barra magnética de agitação	Chemglass	CG-2001-05
Condensador	Chemglass	CG-1218-01
Controlador de Temperatura	BriskHeat	SDC120JC-A
Placa de Mistura	Fisher Scientific	11-100-49SH