Ensaio fluorescente de alta capacidade para estudar interações microrganismo-verme

Resumo

Fonte: Ali, I., et al. Triagem de Alto Débito de Isolados Microbianos com Impacto na Saúde de Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra um ensaio fluorescente de alto rendimento para avaliar como as bactérias intestinais afetam a resiliência ao estresse em Caenorhabditis elegans. Ao rastrear a fluorescência azul dos grânulos intestinais rompidos, o ensaio revela sinais de morte mais antigos em vermes expostos a bactérias testadas.

Protocolo

1. Configuração de Caenorhabditis elegans (C. elegans) sem rótulo (Caenorhabditis elegans) para avaliação de sobrevivência (LFASS) e preparação de ensaios oxidativos (Dias 13 - 14)

1. Avalie o estágio de desenvolvimento dos vermes. Quando >90% dos vermes atingirem L4, colete-os em até 10 mL de solução estéril de M9 em tubos cônicos de 15 mL.
2. Lave as minhocas extensivamente (pelo menos 4 vezes) centrifugando a 142xg por 2 minutos a 4 °C, removendo o sobrenadante e adicionando 10 mL de M9 estéril fresco entre cada lavagem para eliminar a bactéria Escherichia coli OP50. Resuspenda o pellet de minhoca em 10 mL de M9.
3. Transfira 50 μL de solução de verme para um tubo de ligação de baixa superfície contendo 950 μL de M9. Após misturar suavemente o conteúdo do tubo para evitar sedimentação de vermes, use rapidamente uma ponta de pipeta de baixa ligação úmida para transferir 3-4 gotas separadas de 10 μL para uma lâmina de vidro ou uma placa de meio de crescimento nematoide (NGM). Conte os números dos vermes sob um estereomicroscópio com ampliação 16x. Faça a média das contagens das 3-4 gotas e determine o número de vermes por microlitro na solução de vermes.
4. Ajuste a concentração de vermes no tubo de 10 mL para atingir ~120 vermes em 8 μL. Se a solução foi preparada na Etapa 1.2. não estiver concentrado o suficiente, gire as minhocas para baixo e remova M9 de acordo para alcançar 120 minhocas por 8 μL.
5. Transfira 8 μL de solução de verme (~120 vermes) para cada um dos poços das oito placas de NGM-agarose de 96 poços previamente preparadas, usando uma pipeta multicanal ou uma pipeta repetida. Certifique-se de usar ponteiras de baixa retenção para limitar a perda de vermes. Também pode ser necessário cortar as pontas para permitir a presença de grandes minhocas adultas, a fim de limitar o estresse mecânico sobre as minhocas adultas.
   NOTA: O ensaio exige no mínimo 30 vermes vivos e saudáveis para funcionar de forma confiável, mas funciona melhor com cerca de 100 vermes por poço.
6. Incube as placas de NGM-agarose de 96 poços sementes por verme e bactéria a 25 °C por 36 horas.
7. Verifique as placas entre 12 e 24 horas, garantindo que as minhocas permaneçam cheias durante todo o tempo. Se for necessário realimentar, ressuspenda as bactérias dentro da placa de matriz bacteriana de 96 poços armazenada a 15 °C, e adicione até 10 μL da solução bacteriana correspondente às placas de NGM-agarose de 96 poços, onde os vermes correm risco de fome antes do fim do período de incubação de 36 horas (vermes famintos produzirão resultados muito diferentes, Então isso é muito importante).
   NOTA: Os seguintes passos devem ser realizados no 15º dia. Antes de iniciar o ensaio, pode ser necessário otimizar a altura de leitura. A leitura ideal será alcançada 20-50 μm acima do fundo do poço. Isso dependerá do modelo do leitor de placas. Alguns oferecem a possibilidade de um Z-scan, enquanto outros permitem entrada manual de altura. Defina a altura ideal no nível onde o sinal de maior fluorescência azul (365 nm/430 nm) é detectado. Alguns leitores de placas podem operar em altura fixa, otimizada para ensaios de células aderentes, e podem não ser ideais para ensaios LFASS.
8. Após 36 horas, dispense 30 μL de M9 em cada poço da placa de 96 poços.
   NOTA: Para ensaios de tensão térmica, o leitor de placas precisa ter atingido a temperatura necessária para realizar o ensaio e pode precisar ser ligado com antecedência. O protocolo atual usa 42 °C para maximizar a velocidade de eliminação, mas a abordagem se aplica a outras temperaturas acima de 30 °C.
9. Transfira vermes (cerca de 20 μL) para a placa de 384 poços de acordo com os layouts do conjunto, usando pontas de baixa retenção (considere cortar a extremidade das pontas para permitir que minhocas grandes reduzam o estresse mecânico para minhocas adultas).
   NOTA: Para o presente estudo, duas configurações diferentes de leitor de placas são usadas para os dois ensaios descritos aqui (tensão térmica e tensão oxidativa), e, portanto, amostras destinadas a esses dois ensaios não devem ser placadas na mesma placa de 384 poços.
10. Certifique-se de que os leitores de placas estejam configurados corretamente (Tabela 1).
11. Complete as placas de 384 poços com mais M9, visando um volume final de 60 μL por poço. Para o ensaio de estresse térmico, adicione 40 μL de M9 e, para o estresse oxidativo induzido por tert-butil hidroperóxido (t-BHP), adicione 34 μL de M9 em 6 μL de t-BHP.
    1. Comece o ensaio dentro de 2 minutos após adicionar t-BHP (idealmente, todos os vermes devem estar expostos ao t-BHP simultaneamente, com resolução no tempo do ensaio de 2 minutos). Se não for possível, use um temporizador para estimar o tempo gasto pipetando t-BHP antes do início do ensaio, permitindo um ajuste posterior do tempo mediano da morte.
12. Feche os pratos com a tampa transparente. Sele as bordas das placas de 384 poços com fita de proteção (fixando fita sobre a placa e a tampa), garantindo que a fita não passe por cima da tampa ou por baixo da placa. Corte a fita entre a tampa e a placa em intervalos usando um bisturi para permitir a troca de ar e minimizar a evaporação durante o ensaio.
13. Insira a placa no leitor de placas e comece a rodagem. Procure excitar a 365 nm e detectar emissão a 435 nm a cada 2 minutos por 6-12 horas (Tabela 1).
    NOTA: Normalmente, 6 h é suficiente para ensaios de estresse térmico de 42 °C e 8 h para ensaios de estresse oxidativo de 7% t-BHP.

Tabela 1: Configurações de ensaio oxidativo e de tensão térmica. Exemplos de configurações usadas para ensaios de estresse oxidativo (A) e térmico (B) nos leitores de placas de fluorescência usados neste estudo.

Materiais