Extração de Bactérias Apoplásticas Usando um Método de Pressão Baseado em Seringa

Resumo

Fonte: Rufián, J. S., et al, Análise de Célula Única da Expressão dos Genes de Pseudomonas syringae no Tecido Vegetal. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra um método de pressão baseado em seringa para extrair bactérias apoplásicas, que proliferam e formam microcolônias dentro do apoplasto, o espaço intercelular entre as células vegetais. O método fornece amostras bacterianas livres de detritos adequadas para análise de célula única a jusante.

Protocolo

Extração de bactérias do apoplasto

1. Quatro dias após a inoculação, corte a parte aérea da planta Arabidopsis ou a folha inoculada da planta de feijão e coloque-a em uma seringa de 20 mL sem agulha (Figura 2G). Para folhas de feijão, role a folha sobre si mesma, deixando a face abaxial para fora, como mostrado na Figura 2F.
2. Adicione volume suficiente de água destilada para cobrir o tecido (geralmente 10-15 mL).
3. Insira o êmbolo e, com a seringa na posição vertical com a ponta apontada para cima, remova o excesso de ar e bolhas de ar dentro da seringa, batendo suavemente no cano até que todo o ar fique próximo à ponta. Deslize o êmbolo para tirar o ar. Quando houver o mínimo de ar possível dentro da seringa, cubra a ponta do cano com filme de parafina.
4. Pressione cuidadosamente o êmbolo para gerar pressão positiva até que o tecido escureça (Figura 1I e Figura 2H). Depois, puxe o êmbolo para gerar pressão negativa (Figura 1J e Figura 2I). Repita essa etapa de 3 a 5 vezes.
5. Remova o filme de parafina e o êmbolo e colete o fluido contendo as bactérias extraídas do apoplasto, conforme na Figura 2J.

Resultados

Figura 1: Inoculação bacteriana e extração de apoplastos usando plantas de Arabidopsis. (A) Preparação do vaso com a malha metálica devidamente fixada. (B) Semear ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 20 mL			Sem requisitos especiais
Tubos cônicos de 50 mL	Sarstedt
Parafilm	Embalagens plásticas Pechiney
Pinças			Sem requisitos especiais
Câmara de vácuo de 25 cm de diâmetro	Kartell	554
Bomba de vácuo	GAST	DOA-P504-BN