Uma técnica de cromatografia de afinidade para a purificação de uma proteína bacteriana recombinante

Resumo

Fonte: Becker, B., et al. Um ensaio repórter simples baseado em fluorescência para identificar componentes celulares necessários para o tráfego da cadeia da toxina A da ricina (RTA) em leveduras. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra a purificação de uma proteína recombinante marcada com poli-histidina usando cromatografia de afinidade baseada em níquel. Ele descreve etapas importantes, incluindo lise bacteriana por sonicação, clarificação e filtração do lisato, e ligação seletiva e elução da proteína alvo usando imidazol.

Protocolo

1. Purificação do RTA marcado por Him via Cromatografia de Afinidade

1. Sonicar células no gelo usando o seguinte protocolo: pulso de 15 s (20 micrômetros), pausa de 30 s. Repita essa etapa cinco vezes.
2. Lisado de células centrífugas a 21.000 x g e 4 °C por 15 minutos e filtrar o sobrenadante usando um sistema de filtro de seringa estéril (poros de 0,2 μm).
   NOTA: Pellets celulares de amostras sonicadas com sucesso apresentam bordas transparentes.
3. Use um sistema automatizado de purificação equipado com uma coluna de afinidade baseada em Ni²+ de 5 mL para purificar a fração de RTA marcada com His do supernadant....

Resultados

Figura 1: Cromatografia de afinidade representativa e resultados de dessalinização de células de E. coli contendo pET-RTA_(His)6 ou o controle vetorial vazio. (A) Gráfico típico de purifi.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Espectrofotômetro Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		Modelo antigo, outros modelos disponíveis
Ascensão Fluoroskan	Termo Científica	5210470	Modelo antigo, não está mais disponível
ÄKTAPurifier	Termo Científica	28406266	O produto é descontinuado e substituído
Coluna HP do HisTRAP	GE Healthcare	17-5248-02
Coluna de dessalgamento HiTRAP	GE Healthcare	11-0003-29
Filtro estéril Midisart	Sartorius	16534K	Tamanho de poros de 0,2 μm
Kit de ensaio proteico BCA	Furar	23225
Kit de ensaio de 660 nm	Termo Científica	22660
Placas de 96 poços	Termo Científica	260860