Uma técnica de cromatografia de afinidade para a purificação de uma proteína bacteriana recombinante

Resumo

Fonte: Becker, B., et al. Um ensaio repórter simples baseado em fluorescência para identificar componentes celulares necessários para o tráfego da cadeia da toxina A da ricina (RTA) em leveduras. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra a purificação de uma proteína recombinante marcada com poli-histidina usando cromatografia de afinidade baseada em níquel. Ele descreve etapas importantes, incluindo lise bacteriana por sonicação, clarificação e filtração do lisato, e ligação seletiva e elução da proteína alvo usando imidazol.

Protocolo

1. Purificação do RTA marcado por Him via Cromatografia de Afinidade

1. Sonicar células no gelo usando o seguinte protocolo: pulso de 15 s (20 micrômetros), pausa de 30 s. Repita essa etapa cinco vezes.
2. Lisado de células centrífugas a 21.000 x g e 4 °C por 15 minutos e filtrar o sobrenadante usando um sistema de filtro de seringa estéril (poros de 0,2 μm).
   NOTA: Pellets celulares de amostras sonicadas com sucesso apresentam bordas transparentes.
3. Use um sistema automatizado de purificação equipado com uma coluna de afinidade baseada em Ni²+ de 5 mL para purificar a fração de RTA marcada com His do supernadante E. coli filtrado por estéril. Em geral, use uma velocidade de elução de 1 mL/min e resfrie todo o sistema de purificação para evitar a ligação ineficiente da toxina e a perda da atividade tóxica.
   NOTA: Os parâmetros para purificação eficiente de RTA estão listados na Tabela 1.
   1. Resumidamente, equilibre a coluna de afinidade com 20 mL de buffer de ligação para remover o buffer de armazenamento. Aplique sobrenadante filtrado estéril na coluna de afinidade usando uma seringa.
   2. Lave a coluna com 25-35 mL de tampão de ligação para remover as proteínas não ligadas da coluna. Realize a etapa de lavagem até que a absorção UV em 280 nm esteja próxima do valor inicial de UV.
   3. Fração de RTA ligada a eluto em 20-35 mL de tampão de elução (500 mM imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM_{KH 2}PO₄, pH = 7,2) e manter a amostra no gelo (Figuras 1A e Figura 1B).
      NOTA: A elução da fração RTA é marcada por um aumento na absorção de UV. Por favor, note que deve coletar exclusivamente essa fração para evitar contaminação com proteínas ligadas inespecíficas.

Tabela 1: Parâmetros usados para purificação de afinidade baseada em colunas e dessalinização. Lista de todas as configurações relevantes da coluna (por exemplo, vazão, concentração do tampão de elução, equilíbrio e duração da etapa de lavagem) e parâmetros medidos (por exemplo, condutância ou absorção de UV).

Parâmetro de cromatografia de afinidade
Parâmetros de medição	UV (280 nm), Concentração do tampão de elução, Condutância
Configurações	Variável/Unidade	Valor
Vazão	mL/min	1
Pressão máxima na coluna	Mpa	0.35
Comprimento de onda	Nm	280 milhas náuticas
Buffer de ligação	Posição da bomba	Um
Amortecedor de elução	Posição da bomba	B
Amortecedor de elução de concentração inicial	%	0
Compensação de volume do sistema	Ml	10
Equilíbrio em colunas	Ml	20
Injeção de amostra sobre superloop/seringa	Ml	Volume do lisado celular
Etapa de lavagem	Ml	20-35
Etapa de elução	Ml	20-35
Amortecedor de elução de concentração durante a elução	%	100
Recalibração da coluna com 20% de EtOH	Ml	50
Parâmetro de dessalinização
Parâmetros de medição	UV (280 nm), Condutância
Configurações	Variável/Unidade	Valor
Vazão	mL/min	4
Pressão máxima na coluna	Mpa	0.35
Comprimento de onda	Nm	280 milhas náuticas
Buffer de ligação	Posição da bomba	Um
Amortecedor de elução	Posição da bomba	B
Amortecedor de elução de concentração inicial	%	0
Compensação de volume do sistema	Ml	10
Equilíbrio em colunas	Ml	20
Injeção de amostra sobre superloop/seringa	Ml	Volume do lisado celular
Injeção tampão de dessalinização (sorbitol de 0,8 M)	Ml	100
Recalibração da coluna com 20% de EtOH	Ml	50

Resultados

Figura 1: Cromatografia de afinidade representativa e resultados de dessalinização de células de E. coli contendo pET-RTA_(His)6 ou o controle vetorial vazio. (A) Gráfico típico de purifi...

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