Uma técnica de cromatografia de afinidade para a purificação de uma proteína bacteriana recombinante

Resumo

Fonte: Becker, B., et al. Um ensaio repórter simples baseado em fluorescência para identificar componentes celulares necessários para o tráfego da cadeia da toxina A da ricina (RTA) em leveduras. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra a purificação de uma proteína recombinante marcada com poli-histidina usando cromatografia de afinidade baseada em níquel. Ele descreve etapas importantes, incluindo lise bacteriana por sonicação, clarificação e filtração do lisato, e ligação seletiva e elução da proteína alvo usando imidazol.

Protocolo

1. Purificação do RTA marcado por Him via Cromatografia de Afinidade

1. Sonicar células no gelo usando o seguinte protocolo: pulso de 15 s (20 micrômetros), pausa de 30 s. Repita essa etapa cinco vezes.
2. Lisado de células centrífugas a 21.000 x g e 4 °C por 15 minutos e filtrar o sobrenadante usando um sistema de filtro de seringa estéril (poros de 0,2 μm).
   NOTA: Pellets celulares de amostras sonicadas com sucesso apresentam bordas transparentes.
3. Use um sistema automatizado de purificação equipado com uma coluna de afinidade baseada em Ni²+ de 5 mL para purificar a fração de RTA marcada com His do supernadante E. coli filtrado por estéril. Em geral, use uma velocidade de elução de 1 mL/min e resfrie todo o sistema de purificação para evitar a ligação ineficiente da toxina e a perda da atividade tóxica.
   NOTA: Os parâmetros para purificação eficiente de RTA estão listados na Tabela 1.
   1. Resumidamente, equilibre a coluna de afinidade com 20 mL de buffer de ligação para remover o buffer de armazenamento. Aplique sobrenadante filtrado estéril na coluna de afinidade usando uma seringa.
   2. Lave a coluna com 25-35 mL de tampão de ligação para remover as proteínas não ligadas da coluna. Realize a etapa de lavagem até que a absorção UV em 280 nm esteja próxima do valor inicial de UV.
   3. Fração de RTA ligada a eluto em 20-35 mL de tampão de elução (500 mM imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM_{KH 2}PO₄, pH = 7,2) e manter a amostra no gelo (Figuras 1A e Figura 1B).
      NOTA: A elução da fração RTA é marcada por um aumento na absorção de UV. Por favor, note que deve coletar exclusivamente essa fração para evitar contaminação com proteínas ligadas inespecíficas.

Tabela 1: Parâmetros usados para purificação de afinidade baseada em colunas e dessalinização. Lista de todas as configurações relevantes da coluna (por exemplo, vazão, concentração do tampão de elução, equilíbrio e duração da etapa de lavagem) e parâmetros medidos (por exemplo, condutância ou absorção de UV).

Parâmetro de cromatografia de afinidade
Parâmetros de medição	UV (280 nm), Concentração do tampão de elução, Condutância
Configurações	Variável/Unidade	Valor
Vazão	mL/min	1
Pressão máxima na coluna	Mpa	0.35
Comprimento de onda	Nm	280 milhas náuticas
Buffer de ligação	Posição da bomba	Um
Amortecedor de elução	Posição da bomba	B
Amortecedor de elução de concentração inicial	%	0
Compensação de volume do sistema	Ml	10
Equilíbrio em colunas	Ml	20
Injeção de amostra sobre superloop/seringa	Ml	Volume do lisado celular
Etapa de lavagem	Ml	20-35
Etapa de elução	Ml	20-35
Amortecedor de elução de concentração durante a elução	%	100
Recalibração da coluna com 20% de EtOH	Ml	50
Parâmetro de dessalinização
Parâmetros de medição	UV (280 nm), Condutância
Configurações	Variável/Unidade	Valor
Vazão	mL/min	4
Pressão máxima na coluna	Mpa	0.35
Comprimento de onda	Nm	280 milhas náuticas
Buffer de ligação	Posição da bomba	Um
Amortecedor de elução	Posição da bomba	B
Amortecedor de elução de concentração inicial	%	0
Compensação de volume do sistema	Ml	10
Equilíbrio em colunas	Ml	20
Injeção de amostra sobre superloop/seringa	Ml	Volume do lisado celular
Injeção tampão de dessalinização (sorbitol de 0,8 M)	Ml	100
Recalibração da coluna com 20% de EtOH	Ml	50

Resultados

Figura 1: Cromatografia de afinidade representativa e resultados de dessalinização de células de E. coli contendo pET-RTA_(His)6 ou o controle vetorial vazio. (A) Gráfico típico de purifi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Espectrofotômetro Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		Modelo antigo, outros modelos disponíveis
Ascensão Fluoroskan	Termo Científica	5210470	Modelo antigo, não está mais disponível
ÄKTAPurifier	Termo Científica	28406266	O produto é descontinuado e substituído
Coluna HP do HisTRAP	GE Healthcare	17-5248-02
Coluna de dessalgamento HiTRAP	GE Healthcare	11-0003-29
Filtro estéril Midisart	Sartorius	16534K	Tamanho de poros de 0,2 μm
Kit de ensaio proteico BCA	Furar	23225
Kit de ensaio de 660 nm	Termo Científica	22660
Placas de 96 poços	Termo Científica	260860