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1. Preparação de Nanocelulose Bacteriana (BNC)
Nota: Todos os passos são realizados sob condições assépticas, salvo indicação em contrário.
- Prepare o meio de cultura.
- Prepare 500 ml de meio líquido de cultivo combinando 25 g de extrato de levedura, 15 g de peptona, 125,0 g de manitol e 500 ml de água de alta pureza. Autoclave essa mistura a 120 °C por 20 minutos e armazene a 4 °C.
- Prepare 100 ml de meio semisólido adicionando 15 g de ágar a 5,0 g de extrato de levedura, 3,0 g de peptona, 25,0 g de manitol e 100 ml de água de alta pureza. Autoclave essa mistura a 120 °C por 20 minutos. Uma vez autoclavado, deposite 5 ml da mistura em uma placa plástica de Petri de 90 mm x 16 mm. Deixe a solução se gerar em gel a 4 °C e armazene nessa temperatura até o uso adicional.
- Reidrate a cepa de Glucoacetobacter xylinus (G. xylinus) preservada em frascos liofilizados adicionando 1 ml de meio de cultivo líquido e pipeteando para cima e para baixo, conforme indicado pelas instruções do fabricante.
- Inocule as placas de Petri contendo meios semisólidos com pequenas gotículas de suspensão bacteriana usando um laço inoculante. Certifique-se de que o inóculo cubra toda a placa de Petri movendo o laço em ziguezague da borda até o centro da placa.
- Incube as placas de Petri a 26 °C por 72 horas em uma incubadora sem CO2. Após o término do período de incubação, pequenas colônias brancas são visíveis. Se as colônias não forem usadas imediatamente, armazene as placas de Petri a 4 °C selando a tampa com Parafilm e colocando as placas de cabeça para baixo. As colônias podem ser armazenadas dessa forma por até 6 meses.
- Transfira 2 ml do meio de cultura líquida para cada poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços. Pegue duas colônias com uma agulha inoculadora das placas de Petri inoculadas e coloque-as no primeiro poço da placa de cultura de tecidos. Repita o mesmo procedimento para os 23 poços restantes.
- Incube a placa de cultura de tecido a 30 °C por 7 dias. Isso resultará em um total de 24 filmes BNC com diâmetro de 16 mm e espessura de aproximadamente 2-3 mm de diâmetro, conforme mostrado na Figura 1. Nota: Não perturbe a cultura bacteriana em nenhum momento durante o período de incubação, por exemplo, agitando as placas. Durante o período de incubação, G. xylinus extrude moléculas de açúcar de glifociranose para formar uma malha cristalina polimérica na interface ar-líquido, que adota a forma e o tamanho do frasco sob condições estáticas de cultivo. Essa matriz polimérica, conhecida como nanocelulose bacteriana (BNC), é visível no final do período de incubação.
- Colete as películas BNC do meio de crescimento e esterilize-as em 200 ml de solução de NaOH a 1% por 1 hora a 50 °C, para remover todos os vestígios de G. xylinus. Opcionalmente, mexa essa solução a 300 rpm usando uma barra magnética e uma placa de mexer. Descarte a solução de NaOH e adicione 200 ml de solução de NaOH 1% fresca preparada. Repita o mesmo processo mais uma vez ou até que as películas BNC em solução adquiram uma aparência translúcida.
- Enxágue as películas BNC com água três vezes e armazene-as em água de alta pureza no RT. Certifique-se de que as películas BNC estejam completamente submersas na água e não possam secar em nenhum momento.
- Autoclave as películas BNC a 121 °C por 20 minutos. Nota: Um estudo subcutâneo in vivo no rato realizado por Märtson e colegas não mostrou sinais de degradação do BNC após 60 semanas de implantação. De fato, o BNC é degradável na natureza por enzimas microbianas e fúngicas, que estão ausentes em mamíferos. Por outro lado, a biodegradabilidade do BNC pode ser resultado de processos mecânicos, químicos e biológicos que enfraquecem a rede microfibrila in vivo.
