$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Preparação de Produtos Químicos e Equipamentos
1. Produzir 500 ml de uma solução de hexametafosfato de sódio (SHMP) (NaPO3)n a 1% e esterilizar por autoclave.
2. Esterilizar filtros de nitrocelulose (NC) (tamanho de poros 0,22 μm, diâmetro 47 mm) por autoclavagem em placas de Petri de vidro fechadas.
3. Esterilize filtros NC (tamanho de poro 0,22 μm, diâmetro 25 mm) por autoclavagem em placas de Petri de vidro fechadas.
4. Pese e note o peso vazio dos tubos estéreis de 50 ml (com tampo) (um tubo por amostra).
5. Prepare o tampão Tris-EDTA (TE-buffer) 1x: faça uma solução de 10 mM de Tris (tris(hidroximetil)aminometano) e 1 mM de tampão EDTA. Ajuste o pH para 8 e esterilize por autoclave.
6. Prepare a solução de lisozima (20 mg/ml) dissolvendo 0,02 g de lisozima em 1 ml de tampão TE. Idealmente, faça tudo fresco toda vez. Armazene a 4 °C por no máximo 1 semana.
7. Prepare uma solução fisiológica dissolvendo 8 g/L de cloreto de sódio (NaCl) em água destilada. Esterilize por autoclav.
2. Separação da Biomassa do Sedimento
1. Adicionar 3 g de amostra de sedimento a tubos estéreis pré-pesados de 50 ml usando colheres metálicas flamejadas com etanol. Realize isso em um armário de biossegurança limpo, esterilizado por UV, para evitar contaminação.
2. Adicione 15 ml de uma solução SHMP estéril (autoclaveada) a 1% à amostra usando uma bureta graduada estéril. A solução SHMP também pode ser filtrada para evitar contaminação.
3. Homogeneize o sedimento e a solução de SHMP com um dispersor/homogeneizador líquido (por exemplo, homogeneizador Ultra-Turrax). Esterilize 70% o rotor de dispersão com etanol ou autoclave antes do uso. Execute a homogeneização por 1 minuto a 17.500 rpm. Deixe a amostra repousar por 2 minutos e repita a homogeneização por 1 minuto na mesma velocidade do rotor.
4. Deixe a amostra descansar por 10 minutos. Nessa etapa, as partículas mais pesadas (minerais) se acomodarão. As células e quaisquer componentes orgânicos da amostra, no entanto, permanecerão em solução. Depois, transfira a solução sobrenadante (contendo biomassa celular) para um tubo limpo de 50 ml, tomando cuidado para não perturbar o pellet de sedimento.
5. Ao pellet de sedimento, adicione novamente 15 ml de uma solução SHMP estéril a 1% (autoclave) usando uma bureta graduada estéril. Depois, repita os passos 2.3 e 2.4. Essa repetição garante a separação máxima de células e partículas orgânicas do componente mineral do sedimento. O sobrenadante dessa segunda separação pode ser fundido com o sobrenadante da primeira separação.
Nota: As etapas a seguir são todas feitas no sobrenadante (que contém biomassa celular). O componente mineral (pellet de sedimento) pode ser descartado.
6. Centrifuge a amostra a 20 x g por 1 min. Esse passo aumenta a força g o suficiente para depositar pequenas partículas minerais enquanto o material da célula biológica permanece em solução. Após a centrifugação, transfira a solução sobrenadante (contendo biomassa celular) para um tubo limpo de 50 ml. Descarte a pastilha mineral.
7. Determinar o volume final da solução contendo biomassa pesando a amostra. A determinação do peso evita a necessidade de transferir a amostra para um cilindro graduado e reduz o risco de contaminação.
3. Coleta de biomassa na membrana do filtro
1. Prepare uma unidade de filtragem (para membranas de 47 mm de diâmetro) e uma bomba de vácuo. Esterilize a unidade de filtragem seja por autoclav ou (se for vidro Pyrex) borrifando com etanol 70% e queimando com um bico Bunsen. Deixe esfriar antes de continuar com o protocolo.
2. Adicione uma membrana NC estéril à unidade de filtragem usando pinças esterilizadas com chama de etanol.
3. Adicionar metade da amostra sobrenadante (do passo 2.6) à unidade de filtração de membrana e coletar células na membrana usando a bomba de vácuo.
4. Quando o líquido tiver passado completamente pelo filtro, pare a bomba de vácuo e remova cuidadosamente a membrana usando pinças esterilizadas com chama de etanol. Coloque a membrana em uma placa de Petri estéril.
1. Corte a membrana ao meio usando tesouras esterilizadas com chama de etanol. Adicione cada metade da membrana a um tubo separado de 2 ml. Metade da membrana será usada para extração de DNA e análise de toda a comunidade bacteriana. A outra metade do filtro será armazenada a -80 °C e serve como backup.
5. Coloque uma nova membrana NC sobre a unidade de filtragem e colete biomassa da segunda metade do volume da amostra (do passo 2.6) usando a bomba de vácuo.
6. Quando o líquido tiver passado completamente pelo filtro, desligue a bomba de vácuo e remova cuidadosamente a membrana usando pinças esterilizadas com chama de etanol. Coloque toda a membrana em um tubo separado de 2 ml. Essa amostra será usada no tratamento para separar endoesporos das células vegetativas. A amostra pode ser armazenada a -20 °C até o uso.
4. Lise de Células Vegetativas
1. Realizar o tratamento para separar endósporos das células vegetativas na biomassa previamente coletada em uma membrana NC (passo 3.6).
1. Se a membrana estava congelada, deixe-a no RT por 10 minutos para descongelar. Depois, coloque a membrana em uma placa de Petri estéril e corte-a (aproximadamente 4 vezes) em pedaços menores usando tesouras esterilizadas com chama de etanol. Depois, coloque todas as peças do filtro de membrana em um tubo estéril de 2 ml.
2. Adicionar 900 μl de buffer 1x TE (Tris-EDTA) (veja 1,5) ao tubo contendo a membrana da amostra e misturar cuidadosamente por vórtice. Nessa etapa, a biomassa é removida da membrana para a solução tampão TE.
3. Coloque o tubo em uma incubadora a 65 °C por 10 minutos e 80 rpm. Depois, retire o tubo da incubadora e deixe esfriar por 15 minutos.
4. Adicione 100 μl de lisozima fresca preparada (veja 1,5) para atingir uma concentração final de 2 mg/ml. Não adicione a lisozima antes que a amostra tenha resfriado para 37 °C, pois isso pode degradar a enzima.
5. Incubar a amostra a 37 °C por 60 min e 80 rpm, as condições ideais para que a lisia células vegetativas pela lisozia.
6. Após a conclusão da lise, adicione 250 μl de hidróxido de sódio de 3 N (NaOH) e 250 μl de solução de dodecilo sulfato de sódio (SDS) a 6% à amostra. Ao somar isso, o volume da amostra atinge 1,5 ml, e há uma concentração final de 0,5 N NaOH e uma concentração final de 1% SDS.
7. Incube essa mistura em RT por 60 min e 80 rpm. Adicionar a base e os detergentes vai ajudar na lise celular final. A concentração desses detergentes foi otimizada para não danificar os endosporos durante a lisagem das células vegetativas.
8. Prepare uma unidade de filtragem estéril que segure membranas de 25 mm de diâmetro por autoclav, ou (se for vidro Pyrex) pulverizando com etanol 70% e queimando com um queimador Bunsen. Deixe esfriar.
9. Coloque uma membrana NC de 0,2 μm (25 mm de diâmetro) na unidade de filtração usando pinças esterilizadas com chama de etanol.
10. Adicione a amostra do passo 4.7 à membrana e filtre o líquido usando a bomba de vácuo. Quando o líquido passar, desligue a bomba de vácuo. Nessa etapa, o material celular vegetativo lisado é removido, pois não é retido na membrana. Apenas endósporos permanecerão na membrana.
11. Adicione 2 ml de solução fisiológica estéril para lavar os detergentes residuais e filtre o líquido usando a bomba de vácuo.
12. Quando o líquido estiver totalmente filtrado, desligue a bomba de vácuo. Deixe a membrana na unidade de filtragem.