Gerando culturas bacterianas puras em meio líquido

Resumo

Fonte: Brumfield, K. D. et al., Técnicas de Laboratório Usadas para Manter e Diferenciar Biotipos de Isolados Clínicos e Ambientais de Vibrio cholerae . J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o crescimento de culturas bacterianas em meio líquido. A agitação promove a aeração e distribui os nutrientes de forma uniforme, apoiando o crescimento exponencial e resultando em uma suspensão uniforme e metabolicamente ativa, adequada para aplicações a jusante.

Protocolo

1. Manutenção e Crescimento das Cepas de Vibrio cholerae

1. Preparação e Uso de Culturas de Animais Congelados
   1. Pellet 1,8 mL de cultura líquida durante a noite por 2 min por centrifugação (≥8.600 x g) em um tubo estéril de microcentrífuga de 2 mL, remova o sobrenadante e resuspenda o pellet celular em 900 μL de caldo fresco Luria-Bertani (LB) por pipeta.
   2. Adicione 900 μL de glicerol estéril de 60% (v/v) à cultura e misture por meio de vórtice.
   3. Transfira a mistura para um tubo criogênico estéril de 2 mL e armazene indefinidamente a -80 °C.
   4. Para usar, remova uma pequena quantidade de caldo congelado usando um laço e faixa estéril de inoculação para colônias individuais em placas de ágar LB. Retorne imediatamente o caldo congelado a -80 °C após o uso para evitar que as culturas descongelem completamente. Incube as placas com a tampa para baixo por 12 a 16 horas a 37 °C.
2. Crescimento de Culturas Noturnas em Meio Líquido
   1. Faixa para colônias individuais (conforme seção 1.1.4) de material congelado para placas de ágar LB. Incube as placas com a tampa para baixo por 12 a 16 horas a 37 °C.
   2. Inocule 4 mL de caldo LB líquido em um tubo de cultura estéril de 10 mL com uma única colônia, tocando a superfície da colônia única com um aplicador estéril e transferindo a colônia para o caldo líquido.
   3. Incubar com aeração em um incubador shaker a 225 rotações por minuto (rpm) por 12 a 16 horas a 37 °C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
60% de glicerol	Calbioquímica	356352	http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352
Ágar	Becto, Dickinson e Companhia.	214030	http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch
Hcl	Fisher Scientific	A144-212	Corrosivo; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID
Le loop	Decon Labs Inc.	MP190-25	http://deconlabs.com/products/leloop/
Le stab	Decon Labs Inc.	MP186-5	http://deconlabs.com/products/lestab/
NaCl	Fisher Scientific	S271-10	https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID
Placas de Petri (100 mm x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875712	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712
Triptona	Becto, Dickinson e Companhia.	211705	http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch
Extrato de levedura	Becto, Dickinson e Companhia.	212750	http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch