Ensaio de motilidade para comparação de cepas de Vibrio cholerae usando cloreto de trifeniltetrazólio

Resumo

Fonte: Brumfield, K. D., et al. Técnicas laboratoriais usadas para manter e diferenciar biótipos de isolados clínicos e ambientais de Vibrio cholerae . J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra um ensaio de ágar suave usando cloreto de trifeniltetrazólio para avaliar e comparar a motilidade das cepas de Vibrio cholerae visualizando a atividade metabólica por meio da formação de zonas vermelhas ao redor de células ativamente migratórias.

Protocolo

1. Ensaio de Motilidade
   1. Prepare cultura(s) durante a noite das cepas de Vibrio cholerae em caldo líquido LB (Luria-Bertani).
   2. Comprima 1,8 mL da cultura durante a noite por 2 minutos por centrifugação (≥8.600 x g) em um tubo estéril de microcentrífuga de 2 mL e remova o sobrenadante usando uma pipeta. Resuspenda o pellet celular em 1,8 mL 1x PBS (soro tampado com fosfato) por pipetagem.
   3. Repita o procedimento de lavagem três vezes, seguido de uma resuspensão final em 1,8 mL 1x PBS.
   4. Inocule as placas de ágar de motilidade inserindo uma punhalada inoculante na cultura líquida lavada e espetando verticalmente no meio. Entre cada inoculação, esterilize a punhalada de arame usando um bico de Bunsen e, ao esfaquear ágar, certifique-se de que a punhalada inoculadora não dobre, pois isso pode alterar os resultados.
   5. Incube as placas com a tampa para cima por 14 a 24 horas a 37 °C. Após 14 horas, monitore as placas de motilidade de perto para evitar o crescimento excessivo de culturas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ágar	Becto, Dickinson e Companhia.	214030	http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch
Centrífuga de bancada	Eppendorf	5424	Qualquer centrífuga para tubos eppendorf de 1,5ml
Le Stab	Decon Labs Inc.	MP186-5	http://deconlabs.com/products/lestab/
Caldo LB (Miller)	Termo/Gibco	10855021	Para cultura bacteriana estática e medição de OD
Placas de Petri (150 mm x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875714	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID
PBS 1x			Para cultura bacteriana estática e medição de OD
Cloreto de trifeniltetrazólio	Alfa Aesar	A10870	https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/